Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

La variación genética responsable para el alelo de células falciformes (HbS) permite a los eritrocitos para resistir la infección por el parásito de la malaria, P. falciparum. La base molecular de esta resistencia, que se sabe que es multifactorial, sigue siendo incompleta entendido. Estudios recientes han encontrado que la expresión diferencial de microRNAs de eritrocitos, una vez trasladadas en parásitos de la malaria, afectan tanto a la regulación de genes y el crecimiento del parásito. Estos miRNAs se muestran más adelante para inhibir la traducción del ARNm mediante la formación de un transcrito de ARN quimérico a través de 5 'de fusión de ARN con subconjuntos discretos de mRNAs de parásitos. Aquí, las técnicas que se utilizaron para estudiar el papel funcional y la posible existencia de mecanismo microRNAs eritrocitos subyacentes en la regulación de genes y el potencial de la traducción de P. falciparum, incluyendo la transfección de microRNAs sintéticos modificados en los eritrocitos de acogida, se detallará. Finalmente, un método de gradiente de polisomas se utiliza para determinar la extensión de translation de estas transcripciones. En conjunto, estas técnicas nos han permitido demostrar que los niveles de microARN dysregulated eritrocitos contribuyen a la resistencia a la malaria de células intrínseca de los eritrocitos falciformes.

Introduction

La malaria, causada por parásitos apicomplexan del género Plasmodium, es la enfermedad parasitaria humana más común, infectando a nivel mundial unos 200 millones de personas cada año y causa alrededor de 600.000 muertes ^1. De las cinco especies de Plasmodium que infectan a los seres humanos, los más relevantes para las enfermedades humanas son P. falciparum y P. vivax, debido a sus distribuciones generalizadas y el potencial de complicaciones graves de malaria. El ciclo de vida del parásito de la malaria requiere la infección de ambos mosquitos y seres humanos. Cuando un mosquito infectado pica a un humano, los parásitos viajan a través del torrente sanguíneo hasta el hígado, donde se produce una ronda inicial de la replicación. Después de merozoitos ruptura del hepatocito anfitrión, que infectan los glóbulos rojos cercanos, iniciando la replicación sea asexual o sexual. La etapa asexual de replicación, que tiene una duración de 48 horas en P. falciparum, es el foco de este estudio, ya que es a la vez la fuente de la mayoría malsíntomas aria y se recapitulan fácilmente in vitro.

Si bien una serie de iniciativas de salud pública, incluyendo la mejora de los tratamientos contra la malaria, han reducido un poco la carga de la malaria a nivel mundial, la continua aparición de parásitos resistentes a los fármacos presenta un problema para los esfuerzos de control de la malaria. Una de las áreas que pueden sugerir nuevos enfoques terapéuticos es el estudio de cómo las diversas variantes genéticas confieren resistencia a la malaria. En las regiones donde la malaria es endémica, una variedad de polimorfismos eritrocitarios son bastante comunes ^2,3. Estas mutaciones, con células falciformes siendo quizás el más destacado, a menudo se asocian con la resistencia sustancial a la aparición de la infección de la malaria sintomática ^4. Los mecanismos subyacentes por los que causan los eritrocitos para resistir la infección por malaria se conocen por completo. Eritrocitos parasitados con mutaciones de hemoglobina están sujetos a una mayor fagocitosis través rigidez celular mejorada y deshidratación, queestá asociada con la invasión disminuido en P. falciparum ^5. El alelo HbC también afecta a la expresión de proteínas en la superficie de los eritrocitos y con la remodelación del citoesqueleto, inhibiendo aún más el desarrollo del parásito ^6,7. Por último, P. falciparum crece mal dentro falciformes homocigóticos (HBSS) eritrocitos ^8,9 in vitro, lo que sugiere factores eritrocitarios intrínsecas de resistencia a la malaria. Sin embargo, aunque todos estos mecanismos parecen jugar un papel, no explican plenamente los mecanismos detrás de la resistencia de células falciformes a la malaria.

Un conjunto potencial de los factores eritrocitarios que permanecen poco conocida es la gran reserva de miARN presentes dentro de los eritrocitos maduros. Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes, 19-25 de nt en tamaño, que median la traducción y / o estabilidad del ARNm diana por emparejamiento de bases dentro de la 3 'UTR. Ellos han sido implicados en el control de la respuesta inmune de mamíferos, incluyendo el o supresiónla replicación del virus f ^10, y fueron demostrado que confieren resistencia a virus en plantas Ellos también se han demostrado que regulan varios procesos eritrocitarios, incluyendo la eritropoyesis ^11,12 y metabolismo del hierro ^13. Estudios previos identificaron una población abundante y diversa de miRNAs eritrocítica, cuya expresión se alteró dramáticamente en HbSS eritrocitos ^14,15. Puesto que los eritrocitos maduros carecen de la transcripción y la traducción activa, el papel funcional de estos miRNAs eritrocitos sigue siendo poco clara. Como se produce el intercambio de material significativa entre la célula huésped y P. falciparum durante el ciclo de desarrollo intraeritrocitaria (IDC) ^16, se especuló que el perfil de miARN alterado dentro de los eritrocitos HbS puede contribuir directamente a la resistencia a la malaria de células intrínseca.

Estos estudios condujeron en última instancia al desarrollo de una tubería para aislar, identificar y funcionalmente estudiar el papel de los genes miARN humano dentro de la mparásito alaria, P. falciparum, que indicaron que los anfitriones / miRNAs humanos en última instancia, de forma covalente de fusibles y luego reprimir traslación transcripciones de ARNm parásito ^17. Esto proporcionó un ejemplo de las primeras especies cruzadas transcripciones quiméricos formados por trans-empalme e implica que esta fusión miARN-mRNA podría estar ocurriendo en otras especies, incluyendo otros parásitos. Todos los ARNm tripanosoma son trans-empalmados con un empalme-líder (SL) para regular la separación de polycistronic transcripciones ^18. Desde P. falciparum carece ortólogos para Dicer / Ago ^19,20, es posible que los miRNAs eritrocitos secuestran SL maquinaria similar en P. falciparum para integrar en los genes diana. Estudios recientes en P. falciparum tiene, de hecho, indica la presencia de secuencias líder 5 'de empalme ^21. Este estudio detalla los métodos que llevaron al descubrimiento de transcripciones de fusión-humanos parásito miARN-mRNA, incluyendo tanto transcriptómica y translatécnicas de regulación cionales. Los objetivos generales de estos métodos son para investigar los efectos de los pequeños RNAs en la regulación de genes, fenotipos y traducción potencial de P. transcripciones falciparum.

La identificación inicial de los transcritos quiméricos humanos parásito se basó en el uso de técnicas de análisis de ARN, tales como PCR en tiempo real, la secuenciación del transcriptoma y EST captura de biblioteca, que incluía tanto totales y pequeños RNAs, en lugar de utilizar técnicas que sólo aislados pequeños RNAs. Aislamiento de RNA todos juntos en una piscina grande, en lugar de por separado, permitió la identificación de ambos translocados pequeños RNAs humanos en el parásito, así como la presencia de estas pequeñas secuencias de ARN como parte de una secuencia más grande. Esto entonces requiere un análisis del estado traducción de estos mRNAs de fusión para determinar las consecuencias funcionales de estas fusiones.

Mientras que los grandes esfuerzos en la caracterización de un genoma del parásitod transcriptoma han añadido a la comprensión de la biología del parásito ^22-25, mucho menos se sabe acerca de la regulación de la traducción del ARNm transcriptoma en todo el ciclo de vida de P. falciparum ^26. Esta comprensión limitada del proteoma del parásito ha dificultado tanto la comprensión de la biología del parásito y la capacidad de identificar nuevos objetivos para la próxima generación de terapias contra la malaria. Esta brecha en la comprensión de la biología celular del parásito ha persistido en gran parte debido a la falta de técnicas adecuadas para investigar la regulación de traducción en P. falciparum. Un artículo reciente describe el uso de la huella ribosomal de P. falciparum para determinar el estado de la traducción mundial ^21. Una medida bien establecida de potencial de traslación de las transcripciones es el número de ribosomas asociados determinados por polisomas perfilado. Sin embargo, cuando se aplica esta técnica para P. falciparum </ em>, no es capaz de recuperar la mayoría de los polisomas y captura predominantemente monosomas. Recientemente, varios grupos han optimizado ^27,28 P. técnicas polysome falciparum por lisis de los eritrocitos y parásitos simultáneamente para preservar los polisomas y caracterizar la ocupación ribosomal y el potencial de la traducción de estos parásitos de la malaria durante su desarrollo asexual en las células rojas de acogida ^28.

Colectivamente, estos métodos demuestran que la fusión observado de mRNAs miARN y parásitos humanos modula la traducción de proteínas del parásito de esos mRNAs de fusión, que se demostró utilizando métodos reportados previamente ^27, y es un importante factor determinante de la resistencia a la malaria en HbAS y HbSS eritrocitos ^17. Estos métodos podrían ser útiles en cualquier sistema en busca de identificar y funcionalmente explorar eventos de empalme de ARN, ya se trate de los ARN de fusión están a P. falciparum u otros sistemas eucariotas.

Protocol

1: Aislamiento de ARN de pequeño tamaño de P. falciparum Durante la IDC Obtener parásitos de la malaria en la cultura asexual 29. NOTA: El tamaño de la cultura requerida variará en función de la aplicación deseada; sin embargo, un cultivo de 10 ml a 3-5% de parasitemia y 5% de hematocrito proporciona un amplio ARN para PCR en tiempo real (RT-PCR). La técnica se optimizó inicialmente para cultivos asíncronos, pero cuando se desean puntos temporales específicos durante el c…

Representative Results

Perfiles Global de microARN humano en P. falciparum Las técnicas presentadas aquí se utilizaron para extraer microRNAs de parásitos en una variedad de condiciones. Una cosa a destacar es que se realizaron extracciones de ARN para los glóbulos rojos no infectados como se indica en 32, que a menudo sirve como punto de referencia para los datos de microARN presentados tanto en este artículo y el estudio original 29. Esos estudios anteriores también demostrar…

Discussion

HbS es una de las variantes de hemoglobina más comunes en las zonas endémicas de malaria, en gran medida, ya que proporciona protección contra la malaria grave por P. falciparum. Las técnicas necesarias para caracterizar el papel del microRNA humana en la regulación de genes de P. falciparum se detallan a lo largo de este manuscrito. Mediante la extracción de ARN total de una manera tal como para incluir todos los pequeños RNAs, y mediante la realización de un procedimiento de…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)