VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
Verständnis Tumor Klonalität ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und Progression der Erkrankung beteiligt sind. Zusätzlich Verständnis der klonalen Zusammensetzungsänderungen, die innerhalb eines Tumors in Reaktion auf bestimmte Mikroumgebung oder Behandlungen auftreten können, um die Gestaltung komplexer und wirksame Ansätze führen zu beseitigen Tumorzellen. Allerdings hat Tracking Tumor klonale Subpopulationen war aufgrund des Fehlens der unterscheidbaren Markierungen schwierig. Zur Lösung dieses Problems wurde ein VDJ-seq-Protokoll erstellt, um die klonalen Evolution Muster der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) Rückfall durch Ausnutzung VDJ Rekombination und somatische Hypermutation (SHM), zwei einzigartige Features von B-Zell-Lymphomen zu verfolgen.
In diesem Protokoll wurden Next-Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken mit Indexierung Potential von verstärkten umge Immunglobulin-Schwerkette (IgH) VDJ-Region von Paaren von Primärdiagnose und Rückfall DLBCL samp aufgebautles. Im Durchschnitt mehr als eine halbe Million VDJ-Sequenzen pro Probe wurden nach Sequenzierung, die sowohl VDJ Umlagerung und SHM Informationen enthalten erhalten. Zusätzlich wurden angefertigt Bioinformatik Leitungen entwickelt und vollständig genutzt Sequenzinformation für die Charakterisierung der IgH-VDJ Repertoire in diesen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die Pipeline des Wiederaufbaus und der Vergleich der klonalen Architektur der einzelnen Tumoren, die die Prüfung des klonalen Heterogenität innerhalb der Diagnose von Tumoren und Abzug der klonalen Evolution Muster zwischen Diagnose und Rezidivtumor Paaren ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Analyse auf mehrere Diagnose-Rückfall-Paare aufgedeckt haben wir wichtige Beweismittel, dass mehrere Unterscheidungstumor evolutionären Muster könnte zu DLBCL Rückfall führen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch auf andere klinische Aspekte wie Identifizierung der minimalen Resterkrankung, Überwachung Rückfall Fortschritt und Ansprechen auf die Behandlung und Untersuchung von Immun Repertoire erweitert werdenn in nicht-Lymphom Kontexten.
Introduction
Krebs ist eine klonale Erkrankung. Seit vor dreißig Jahren, als Peter C. Nowell vorgeschlagen, den Krebs zu klonalen Evolution Modell 1 haben viele Studien versucht, klonalen Populationen innerhalb Tumorproben zu sezieren und zu rekonstruieren klonalen Expansion und Evolution Muster, die die Tumorentstehung Prozess 2 zugrunde liegen. Vor kurzem hat Vollgenomsequenzierung Forschern ermöglicht, einen tiefen Blick auf die klonalen Heterogenität und Evolution 3,4 zu nehmen. Aufgrund des Mangels an tractable Marker in vielen Zelltypen ist es jedoch schwierig, die genaue klonalen Architektur und Entwicklungspfad abzuleiten. Glücklicherweise gibt es eine natürliche Klonalität Marker in reifen B-Zellen, aus denen viele malignen Lymphomen, einschließlich DLBCL, stammen. Als Antwort auf Antigen-Stimulation, wobei jede B-Zelle kann eine einzelne produktive IgH VDJ Sequenzsegment zusammen aus einem großen Pool von diesen Segmenten zu bilden, durch Verbinden einer V H (variable), eine D (Diversity) und ein J H (Verbindung). Während dieser process können kleine Teile der ursprünglichen Sequenz deletiert werden und zusätzliche ohne Matrize Nukleotide können verwendet werden, um eine einzigartige VDJ-Rearrangement erstellen. Diese spezifische VDJ Umlagerung kann in allen Nachkommen dieser B-Zelle geerbt werden daher Tagging einzelne reife B-Zelle und ihrer Nachkommenschaft 5. Weiterhin tritt SHM an rekombinierten VDJ-Sequenzen in der anschließenden Keimzentren (GC) Reaktion zur zusätzlichen Mutationen für die Erweiterung des Antikörperpool und die Verstärkung der Antikörperaffinität 6 einzuführen. Daher wird durch Vergleich und die Gegen VDJ und SHM Muster Lymphom Proben, die diese Prozesse durchlaufen haben könnte intratumorale Heterogenität abzugrenzen und klonale Entwicklungsweg der Krankheit kann abgeleitet werden.
Bisher konnten VDJ-Rearrangement und SHM durch PCR Amplifikation der rekombinierten Bereiche, Klonierung der PCR-Produkte, und anschließend die Sanger-Sequenzierung, um Sequenzinformation zu erhalten, identifiziert werden. Dieser Ansatz is niedrigem Durchsatz und niedrige Ausbeute, Abrufen nur einen sehr kleinen Teil des gesamten rekombiniert VDJ Repertoire und innerhalb einer gegebenen Probe behindern die Charakterisierung der Gesamtdarstellung der klonalen Population. Ein modifizierter Ansatz wurde von Erzeugung NGS indexiert Sequenzierungsbibliotheken von VDJ PCR-Produkte und die Durchführung PE 2×150 bp-Sequenzierung, um mehr als eine halbe Million rekombiniert VDJ-Sequenzen pro Probe zu erhalten erstellt. Darüber hinaus wurde eine benutzerdefinierte Pipeline entwickelt, um die Qualitätskontrolle (QC) durchführen, richten, Filter VDJ Sequenzierung liest den Umlagerungen und SHM jedes Lese identifizieren und durchzuführen phylogenetische Analyse auf der klonalen Architektur jeder Probe. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz wurde gegründet, um weiteren Charakterisierung der klonalen Evolution Muster für Proben bei verschiedenen Krankheitsstadien gesammelt.
Wir haben diese Technik, um DLBCL Patientenproben angewendet. DLBCL ist eine aggressive Form von Non-Hodgkin-Lymphom mit häufigen Rückfällen in bis zu einem third der Patienten 7. DLBCL Rückfälle in der Regel früh auftreten, innerhalb von 2 bis 3 Jahren von der ersten Diagnose, obwohl einige haben nach 5 Jahren 8 auftreten. Prognose für die Rückfall-Patienten ist schlecht, mit nur 10% zu erreichen 3 Jahre das progressionsfreie Überleben aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Dies ist die Grundlage, um den dringenden Bedarf an neuen Ansätzen zur DLBCL Rezidiv 9,10 behandeln. Allerdings sind die molekularen Mechanismen mit DLBCL Rückfall assoziiert noch weitgehend unbekannt. Insbesondere ist die Rolle von klonalen Heterogenität bei der Diagnose und klonale Entwicklung während DLBCL Rezidiv Entwicklung derzeit nicht charakterisierten, was es schwierig macht, eine genaue und nützliche Biomarker Rezidiv vorher definieren. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir unsere angelegten VDJ-Sequenzierungsansatz auf mehreren paarweise mit identischer Primärdiagnose-Rückfall DLBCL Probenpaare. Zwei verschiedene klonale evolutionären Szenarien Rezidiv aus dem Vergleich der klonalen Architekturen zwischen der Diagnose und Rezidiv samp tauchtles, die mehrere molekulare Mechanismen schlägt in DLBCL Rückfall einbezogen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der nahezu unbegrenzten Anzahl von Iterationen der Sequenzinformation von VDJ Umlagerung und SHM am IGH-Locus der humanen B-Zellen kodiert, Untersuchung des gesamten IGH Repertoire von Hochdurchsatz-deep-Sequenzierung erwies sich als eine effiziente und umfassende Weise zu umreißen klonalen sein und Sub-klonale B-Zellpopulationen. Darüber hinaus kann diese Strategie verwendet, um die klonale Entwicklungspfad von B-Zell-Tumor-Entwicklung, Remission, und Rückfall durch Vergleich der klonalen und Unter klonalen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
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