이 프로토콜은 딥 시퀀싱(deep-sequencing)을 통해 림프종의 재조합된 면역글로불린 중쇄 VDJ 영역을 조사하고 VDJ 재배열 및 체세포 과돌연변이 상태를 검색하여 개별 종양의 클론 구조를 설명하는 방법을 설명합니다. 쌍을 이룬 진단과 재발 샘플 사이의 클론 구조를 비교하면 림프종 재발 클론 진화 모드가 밝혀집니다.
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방법 논문
VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석
이 논문에서
요약
초록
이해 clonality 종양은 종양 및 질병 진행에 관련된 메카니즘을 이해하는 데 중요하다. 또한, 특정 미세 환경 또는 치료에 응답 종양 내에 발생 클론 조성 변화를 이해하는 것은 종양 세포를 근절보다 정교하고 효과적인 접근 방법의 설계로 이어질 수있다. 그러나 트래킹 서브 종양 클론 개체군 인해 구별 마커의 부족으로 인해 도전되고있다. 이 문제를 해결하기 위해, VDJ-SEQ 프로토콜은 VDJ 재조합 및 체세포과 돌연변이 (SHM), B 세포 림프종의 두 고유의 기능을 이용하여 확산 큰 B 세포 림프종 (DLBCL) 재발의 클론 진화 패턴을 추적하기 위해 만들어졌습니다.
이 프로토콜에서, 인덱싱 가능성을 가진 차세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리는 기본 진단 및 재발 DLBCL의 SAMP 쌍에서 증폭 재 배열 면역 글로불린 중쇄 (IGH) VDJ 지역에서 건설되었다레. 샘플 당 평균 이상 만 절반 이상 VDJ 서열은 VDJ 재배치와 SHM 정보를 모두 포함 시퀀싱, 후 얻었다에. 또한, 사용자 정의 생물 정보학 파이프 라인은 완전히 이러한 샘플 내 IGH-VDJ 레퍼토리의 특성에 대한 서열 정보를 이용하기 위해 개발되었다. 또한, 파이프 라인은 재건 및 진단 종양 진단 및 재발 종양 쌍 사이 클론 진화 패턴 공제 내의 클론 이질성의 시험을 가능 개별 종양 클론 구조의 비교를 허용한다. 여러 진단 - 재발 쌍에이 분석을 적용 할 때, 우리는 여러 독특한 종양 진화 패턴 DLBCL 재발로 이어질 수 있다는 키 증거를 발견. 또한,이 방법은 최소 잔존 질환의 식별, 진행 및 재발 치료 반응을 모니터링하고, 면역 repertoir 조사 등의 다른 임상 적 형태로 확장 될 수있다비 림프종 상황에서 에스.
서론
암은 클론 질환이다. 30 년 전에는 피터 C. Nowell는 암 클론 진화 모델 1을 제안 언제부터, 많은 연구는 종양 샘플에서 클론 인구를 해부하고, 종양 발생 과정 (2)를 기초 클론 확장과 진화 패턴을 재구성하기 위해 노력했다. 최근 전체 게놈 시퀀싱은 클론 이질성과 진화 3,4에 깊은 살펴보고 수사를 가능하게했다. 그러나, 다수의 세포 유형에서 취급 용이 마커의 부족으로 인해, 그것은 정확한 클론 아키텍처 진화 경로를 추정하는 것은 곤란하다. 다행히 DLBCL 등 많은 림프 악성 종양이, 유래하는 성숙 B 세포에서 자연 clonality 마커가있다. 항원 자극에 반응하여 이들의 세그먼트 큰 풀에서 함께 세그먼트를 각각 B 세포는 V의 H (가변), D (다이버 시티)을 접합하여 하나의 생산성 IGH VDJ 서열을 형성 할 수 있고, J H는 (결합). 이 홍보 중ocess 원래 서열의 작은 부분이 삭제 될 수 있고, 추가로 비 - 템플릿 뉴클레오티드 고유 VDJ 재 배열을 만들기 위해 첨가 될 수있다. 이 특정 VDJ 재배치 따라서 개인의 성숙 B 세포와 그 자손 (5) 태그,이 B 세포의 모든 자손에 상속 할 수 있습니다. 또한, SHM는 항체의 풀 팽창 및 항체....
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프로토콜
1. VDJ 증폭
종양 샘플에서 1.1) DNA 추출
- 냉동 10월 임베디드 정상 또는 악성 조직의 얇은 부분 (10 ~ 20 μm의)에서 DNA를 추출합니다.
- 테 K와 (0.5 ㎎ / ㎖, 최종 농도 4 ml의 핵산 용해 버퍼 (; 0.3 M의 NaCl 0.002 M 나 2 EDTA 0.0075 M 트리스 염산, pH를 8.2)에 그라 이오 스탯 마이크로톰로 절단 포함 된 조직의 10 ~ 30 얇은 섹션 다이제스트 )와 하룻밤 37 ° C의 물을 욕조에 15 ㎖의 원심 분리 관에 0.625 % SDS.
- 소화 혼합물에 포화 염화나트륨 (5 M)의 1 ML을 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어.
- 실온에서 15 분 동안 1,100 XG 원심 분리기.
- 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송하고 100 % 에탄올의 두 볼륨을 추가합니다.
- 튜브에게 6-8 번 반전 섞는다. 4 ° C에서 60 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기는 침전 된 DNA를 수집합니다.
- 70 % 에탄올로 두 번 DNA 펠렛을 세척 하였다. 하기 Centr15 분 펠렛을 수집 할 때마다 5,000 XG에 ifuge.
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결과
DNA 추출을 포함 VDJ 서열 (VDJ-SEQ)의 전반적인 절차는, 처리 및 계통 발생 분석을 판독 VDJ 영역 증폭 및 정제, 서열 라이브러리 구성을 재결합,도 1에 표시된다. 일상적 5-200 μg의의 DNA로부터 검색 될 수있다 냉동 고체 조직 섹션 또는 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 0.5 ~ 20 μg의 DNA를. 품질, 재 배열 패턴 및 개별 샘플 SHM 정도에 따라 다른 샘플로부터 VDJ 증폭 산물의 다양성을 얻을 수 있었다 (도 2), IGVHFR1 (3백10부터 3백80까지 BP), FR2 (2백50부터 2백95까지 BP)를 포함 FR3 (70-120 BP). 단지 FR3 VDJ 단편 PCR로부터 획득 될 수있는 샘플 인해 하류 데이터 분석 목적 서열 정보의 충분한 양을 제공하지 않는 짧은 제품에 나머지 연구에서 제외 하였다. 주요 FR1 또는 FR2 PCR 생성물 번째에 가시화 될 수있는 단지 샘플예를 아가로 스겔은 시퀀싱 라이브러리를 생성하.......
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토론
때문에 인간 B 세포 IGH 유전자좌 VDJ 재 배열 및 SHM에서 부호화 순서 정보의 반복 거의 무제한, 높은 처리량 깊은 시퀀싱하여 전체 IGH 레퍼토리 검사 클론 서술하는 효율적이고 광범위한 방법 입증 및 서브 클론 B 세포 집단. 더욱이, 이러한 전략은 질환의 다양한 단계를 따라 수집 된 환자 샘플의 클론과 서브 클론 구조를 비교하여 B 세포 종양 발생, 경감 및 재발 클론 진화 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. 기본 샘플 DNA에서 재 배열 된 VDJ 서열의 증폭을 용이하게 시판되는 프라이머를 사용하여 실험실 환경에서 수행되지만, 증폭 효율이 샘플 DNA의 품질에 크게 의존한다. 특히, FFPE 시료에서 추출한 DNA는 낮은 증폭 효율을 발휘하고, 종종 작은 FR3 단편으로부터 성공적으로 증폭 될 수있다샘플을 후속 분석을 위해 그들을 적합하지 않다. 여기에 설명 된 우리의 연구는 하나 또는 여러 개의 주요 클론은 전체 종양을 지배와 클론 질환으로 B 세포 림프종의 clonality을 이해하기 위해 설계 되었기 때문.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 사려 깊은 토론을 해준 Rita Shaknovich 박사와 Elemento lab, Melnick lab, Tam lab의 구성원들에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 VDJ 염기서열분석을 수행해 주신 Weill Cornell Medical College의 Genomics Resources Core Facility에도 감사드립니다. YJ는 ASH Scholar Award의 지원을 받았습니다. WT 및 OE는 Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant의 지원을 받습니다. OE는 NSF CAREER 상, Starr Cancer Consortium 및 Hirschl Trust의 지원을 받습니다. 또한 이 프로젝트에 대한 관대한 지원에 대해 Katherine Benesch, JD, MPH에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에탄올 | VWR | 89125-170 | 200 proof, 분자 생물학 |
| TE 버퍼 | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris· Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| 단백질분해효소 K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) 용액 믹스 | Promega | U1515 | 10 mM 각 뉴클레오티드 |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer 및 MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µ l 5 U/µ에서; l |
| 표본 제어 크기 사다리 | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 반응 |
| IGH 체세포 과돌연변이 분석 v2.0 - 겔 검출 | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 반응, IGVHFR1 검출 |
| IGH 유전자 클론성 분석을 위한 믹스 2 - 겔 검출 | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 반응, IGVHFR2 검출용 튜브 B |
| GoTaq Flexi DNA 중합효소 | Promega | M8291 | 20 µ l 5 U/µ에서; l |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) 버퍼 | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50X TAE 버퍼 | VWR | 101414-298 | 1 L |
| 에티듐 브로마이드 용액 | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µ g/&마이크로; l |
| 100 bp DNA 사다리 | 생활 기술 | 15628-019 | 1 &마이크로; g/&마이크로; l |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% 아크릴아미드/비스 솔루션 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 500ml | |
| QIAquick Gel 추출 키트 | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA 고감도 분석 키트 | Life Technologies | Q32854 | |
| 고감도 DNA 키트 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 바이오분석기 | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 형광계 | Life Technologies | Q32872 | |
| 재현탁액 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| 엔드 복구 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-테일링 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| 연결 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA 어댑터 인덱스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR 프라이머 칵테일 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR 마스터 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| 마그네틱 스탠드 | Life Technologies | 4457858 | |
| 젤 이미징 시스템 | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
참고문헌
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al.
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