VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
Anlama tümör klonalite tumorigenezden ve hastalığın ilerlemesi yer alan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir mikro-ortam veya uygulamaya yanıt olarak bir tümör içinde meydana klonal bir bileşim değişiklikleri anlama tümör hücrelerini yok etmek için daha gelişmiş ve etkili yöntem tasarımına yol açabilir. Ancak, izleme tümör klonal alt popülasyonları nedeniyle ayırt belirteçlerin eksikliği zor olmuştur. Bu sorunu çözmek için, bir VDJ seq protokol VDJ rekombinasyonu ve somatik hipermutasyona (SHM), B hücreli lenfomalarda iki benzersiz özellikleri istismar ederek diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) nüks klonal evrim modellerini izlemek için oluşturuldu.
Bu protokolde, indeksleme potansiyeli ile Yeni Nesil sıralama (NGS) kütüphaneler birincil tanı ve nüks DLBCL samp çiftleri amplifiye yeniden düzenlenmiş immünoglobulin ağır zincir (IgH) VDJ bölgesinden inşa edildiles. Numune başına ortalama milyondan fazla yarısı VDJ dizileri VDJ yeniden düzenleme ve SHM bilgilerini bir arada bulunduran sıralama, sonra elde edildi On. Buna ek olarak, özel biyoinformatik boru hatları tamamen bu örneklerin içinde IgH-VDJ repertuar karakterizasyonu için sırası bilgilerini kullanmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, boru hattı yeniden yapılanma ve tanı tümörlerinin tanı ve nüks tümör çiftleri arasındaki klonal evrim kalıpları düşüldükten içinde klonal heterojenite incelenmesini sağlayan bireysel tümörlerin klonal mimarisi, karşılaştırılmasına olanak sağlar. Birkaç tanı nüks çiftleri bu analizi uygularken, birden fazla ayırt edici tümör evrimsel modeller DLBCL nüks yol açabilecek önemli kanıtlar ortaya çıkardı. Ayrıca, bu yaklaşım, minimal rezidüel hastalığın tanımlanması, nüks ilerleme ve tedaviye yanıtı izlemek ve bağışıklık repertuarıyla soruşturma gibi diğer klinik yönlerini içine genişletilebilirolmayan lenfoma bağlamlarda es.
Introduction
Kanser klonal bir hastalıktır. Otuz yıl önce Peter C. Nowell kanseri klonal evrim modeli 1 teklif Ne zamandan beri birçok çalışma tümör örnekleri içinde klonal popülasyonları incelemek ve tumorigenezden sürecini 2 altında yatan klonal genişleme ve evrim modellerini yeniden denedim. Son zamanlarda, bütün genom dizileme klonal heterojenite ve evrim 3,4 derin bir bakmak araştırmacıları sağladı. Ancak, pek çok hücre tipinde izlenebilir belirteçlerin eksikliği nedeniyle, kesin klonal mimari ve evrimsel yolu sonucuna zordur. Neyse DLBCL dahil olmak üzere birçok lenfoid maligniteler, kaynaklandığı olgun B hücrelerinde doğal bir klonalite işareti vardır. Antijen uyarılmasına tepki olarak bu segmentlerin büyük bir havuzdan bir araya segmenti, her bir B-hücresi V H (değişken), D (çeşitlilik) katılarak tek bir üretim IgH VDJ sekansı meydana getirebilir, ve J, H (birleştirme). Bu pr sırasındakapsayabilecektir orijinal dizisinin küçük porsiyonlarda silinebilir ve ek olmayan şablonu nükleotidleri benzersiz VDJ yeniden düzenlenmesini oluşturmak için ilave edilebilir. Bu özel VDJ yeniden düzenlenmesi, bu nedenle bireysel olgun B-hücresi ve yavrular 5 etiketleme, bu B-hücre tüm yavrularında kalıtsal olabilir. Bundan başka, antikor, SHM havuz genişlemesi ve antikor afinite 6 arttırılması için ek mutasyonlar dahil etmek için daha sonra germinal merkez (GC) reaksiyonunda rekombine VDJ sekanslarda ortaya çıkar. Bu nedenle, karşılaştırma ve bu işlemleri geçirmiş lenfoma örnekleri VDJ ve SHM desen karşılaştırarak, tümör içi heterojenlik tarif edilebilir ve hastalığın gelişimi klonal yolu saptanabilecektir.
Daha önce, VDJ yeniden düzenlenme ve SHM sekans bilgilerini elde etmek için PCR ürünleri, ve daha sonra Sanger sıklıklaştırıcı klonlama, rekombine bölgeleri amplifiye PCR ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, iTüm rekombine VDJ repertuarının, sadece çok küçük bir bölümünü almak ve belirli bir örnek içinde klonal nüfusun genel temsil karakterizasyonu engelleyen, düşük verimlilik ve düşük bir verim s. Modifiye yaklaşım VDJ PCR ürünlerinden NGS endeksli sıralama kütüphaneleri üreten ve numune başına daha yarım milyondan fazla rekombine VDJ dizileri elde etmek için PE 2×150 bp sıralama yapılarak oluşturuldu. Buna ek olarak, özel bir boru hattı filtre VDJ dizileme her okuma düzenlenmeleri ve SHMS belirlemek ve her numunenin klonal mimarisi üzerine filogenetik analizi gerçekleştirmek için okur, kalite kontrol (QC) gerçekleştirmek hizalamak için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, yeni bir yaklaşım daha çeşitli hastalık evrelerinde toplanan örneklerin klonal evrim modellerini karakterize etmek kurulmuştur.
Biz DBBHL hasta numunelerinin için bu tekniği uyguladık. DBBHL kadar bir inci sık nüks ile non-Hodgkin lenfoma saldırgan formudurHastaların 7 ird. Yaklaşık 5 yıl 8 sonra meydana rağmen DLBCL nüksler normalde ilk tanı 2 ila 3 yıl içinde erken ortaya çıkar. Nüksetmiş hastalarda prognoz sadece% 10 nedeni tedavi seçenekleri kısıtlı 3 yıllık progresyonsuz sağkalım elde kötüdür. Bu DBBHL nüks 9,10 tedavisinde yeni yaklaşımlar için acil ihtiyaç için temeldir. Ancak, DBBHL nüks ile ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, DBBHL nüks gelişimi sırasında tanı ve klonal evrim de klonal heterojenite rolü, halen uncharacterized olan zor nüks tahmin etmek doğru ve yararlı bir biyobelirteci tanımlamak için yapım. Bu soruları gidermek için, biz eşleşti primer tanı nüks DBBHL örnek çiftlerinden birden çiftleri bizim VDJ-sıralama yaklaşımı uygulandı. Nüks İki farklı klonal evrim senaryoları tanı ve nüks samp arasındaki klonal mimarileri karşılaştırıldığında ortaya çıkanBirden moleküler mekanizmaları öneriyor les DLBCL nüks tutulabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çünkü insan B hücrelerinin IGH loküsündeki VDJ düzenlenmesi ve SHM tarafından kodlanmış dizi bilgi iterasyon neredeyse sınırsız sayıda, yüksek hacimli derin dizileme ile tüm IGH repertuarının inceleme klonal çizmek için etkin ve kapsamlı bir yol olduğunu kanıtladı ve alt klonal B hücre popülasyonları. Bundan başka, bu strateji hastalığın çeşitli evrelerinde boyunca alınmış hasta örneklerinin klonal ve alt klonal mimarileri karşılaştırarak B hücre tümör gelişiminin remisyon ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
