The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
غدة البروستاتا هو نسيج غير متجانسة تتكون من ظهارة إفرازية مرتبة في عنيبات غدي محاط عضلي ليفي سدى تتألف أساسا من العضلات الملساء 1. وتتألف المقصورة الظهارية من خمسة أنواع مختلفة من الخلايا ولكن المنظمة: الخلايا القاعدية والخلايا الإفرازية، خلايا الغدد الصم العصبية والخلايا العابر تضخيم والخلايا الجذعية 2. في سرطان البروستاتا (PCA)، الذي ينشأ من الخلايا الظهارية اللمعية، نمو غدية يسبب الانخفاض التدريجي الواضح من المقصورة اللحمية 3. لهذه الأسباب، فإن عينات الأنسجة لديها اختلافات واضحة في نسبة اللحمية ونوع الخلايا الظهارية على أساس مدى محكمة التحكيم الدائمة. هذه الاختلافات يمكن أن يؤدي إلى الافتراضات متحيزة للبيانات التعبير الجيني تم الحصول عليها من أنسجة كاملة دون النظر إلى تسليخ مجهري من نوع الخلايا المطلوبة. لذلك، لإزالة هذا التحيز من الضروري فصل أنواع الخلايا قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني.
Macrodissection أو تسليخ مجهري يمكن استخدامها لفصل جسديا المناطق الظهارية تتميز جيدا من سدى المحيطة 4 -6. وعادة ما يتم Macrodissection بشفرة حلاقة تحت المجهر تشريح ويعمل بشكل جيد لفصل كبير PCA العقيدات من سدى، ولكنها ليست قادرة على إزالة ظهارة حميدة من المحيط سدى (انظر مثال حميدة الأنسجة البروستاتا في الشكل 1). تسليخ مجهري مع ليزر (LCM) هو أكبر بكثير من العمل المكثف من macrodissection، ولكن يمكن تشريح دقيق للغاية ظهارة حميدة 4.
وقد أظهرت المنشورات الحديثة من مختبرنا أن RNA يمكن استخراجها بنجاح LCM إما جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الخزعات الثابتة الفورمالين أو الأنسجة المجمدة 4،7-9. التحديات الرئيسية في استخراج LCM-RNA هي 1) لتشريح دقيق للمناطق المطلوب من الأنسجة، و2) للحفاظ RNA سلامة خلال (4،10) LCM وعزل العملية. RNA معزولة عن السكان الخلية نقية يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني عن طريق عدة طرق منها العكسية النسخ PCR الكمي (RT-QPCR) 7،8، ميكروأري 11، و-sequencing عمق 12-14.
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي مجموع من ظهارة LCM البروستاتا من الأنسجة المجمدة ليحلل المصب التعبير الجيني.
التنميط الجيني التعبير من العينات البشرية يمكن أن يكون تحديا، ليس فقط بالنسبة للنوعية أو كمية من النسيج المتاحة، ولكن أيضا لمختلف الكيانات النسيجية الموجودة في عينة نسيج معين. هذا هو تحديا من نوع خاص في البروستاتا الذي أنسجة حميدة إلى حد كبير الأنسجة اللحمية ومجالا?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |