Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
La glándula prostática es un tejido heterogéneo compuesto de epitelio secretor dispuestos en los acinos glandulares rodeado por estroma fibromuscular compuesto principalmente de músculo liso 1. El compartimiento epitelial está formado por cinco tipos de células diferentes, pero organizados: células basales, células secretoras, células neuroendocrinas, células de amplificación de tránsito y las células madre 2. En el cáncer de próstata (CaP), que surge de las células epiteliales luminales, el crecimiento de la adenocarcinoma provoca una disminución progresiva evidente del compartimiento del estroma 3. Por estas razones, las muestras de tejido tendrán claras diferencias en la proporción de estroma y el tipo de células epiteliales basado en la medida del CaP. Estas diferencias pueden conducir a suposiciones sesgadas de los datos de expresión de genes adquiridos de tejidos enteros sin tener en cuenta microdisección del tipo celular deseado. Por lo tanto, para eliminar este sesgo es esencial para separar los tipos de células antes de la extracción de RNA yanálisis de expresión génica.
Macrodissection o microdisección se pueden utilizar para separar físicamente las zonas epiteliales bien caracterizados desde el estroma circundante 4 -6. Macrodissection se realiza típicamente con una hoja de afeitar bajo un microscopio de disección y funciona bien para la separación de gran CaP nódulos de estroma, pero no es capaz de eliminar el epitelio benigno del estroma circundante (véase el ejemplo de la histología benigna de la próstata en la Figura 1). Microdisección con láser (LCM) es significativamente más mano de obra que macrodissection, pero puede diseccionar de forma muy precisa el epitelio benigno 4.
Publicaciones recientes de nuestro laboratorio han demostrado que el ARN se puede extraer con éxito por LCM ya sea de (FFPE) biopsias incluidas en parafina fijado en formol o tejido congelado 4,7-9. Los principales desafíos en la extracción de RNA son LCM-1) para diseccionar con precisión las áreas deseadas del tejido, y 2) para preservar RIntegridad NA durante el proceso de 4,10 LCM y el aislamiento. ARN aislado de poblaciones de células puras puede ser utilizado para el análisis de la expresión génica mediante varios métodos que incluyen transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, y profundo -sequencing 12-14.
El objetivo de este protocolo es aislar ARN total de epitelio prostático LCM de tejido congelado para análisis de aguas abajo de la expresión génica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perfiles de expresión génica de muestras humanas puede ser un reto, no sólo por la calidad o cantidad de tejido disponible, sino también por las diversas entidades histológicas presentes en una muestra de tejido dado. Esto es particularmente difícil en la próstata en el que los tejidos benignos son en gran parte los tejidos del estroma y áreas de cáncer están desprovistos de estroma. LCM facilita la separación física de estroma prostático y ARN epitelio para una firma más precisa de los dos tipos diferente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
