RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
전립선은 주로 평활근 1로 구성 fibromuscular 기질에 둘러싸여 샘 꽈리에 배치 분비 상피 세포로 구성된 이종 조직이다. 기저 세포 분비 세포, 신경 내분비 세포, 중계 증폭 세포 및 줄기 세포 2 : 상피 구획 다섯 다르지만 조직 유형의 세포로 구성된다. 내강 상피 세포로부터 발생 전립선 암 (PCA)에있어서, 선암 성장 기질 구획 (3)의 점진적인 하락 분명시킨다. 이러한 이유로, 조직 표본은 PCA의 정도에 기초하여 기질과 상피 세포 유형의 비율 뚜렷한 차이가있을 것이다. 이러한 차이는 원하는 세포 유형의 미세 절제에 관계없이 전체 조직에서 얻은 유전자 발현 데이터의 바이어스 된 가정을 초래할 수있다. 따라서, 이러한 바이어스를 제거하는 것이 종래 RNA 추출 및 세포 유형을 분리하는 것이 필수적이다유전자 발현 분석.
Macrodissection 미세 절제 또는 물리적 주변 기질 4 -6에서 잘 특성화 상피 영역을 분리하기 위해 사용될 수있다. Macrodissection는 일반적으로 해부 현미경 면도날으로 수행하고 큰 PCA는 기질에서 결절 분리 잘 작동하지만, 기질 주변에서 양성 상피를 제거 할 수 없습니다 (그림 1에서 양성 전립선 조직 검사의 예를 참조). 레이저 (LCM)와 미세 절제는 macrodissection보다 훨씬 더 많은 노동 집약적이지만, 매우 정확하게 양성 상피 (4)를 해부 할 수 있습니다.
우리의 실험실에서 최근 출판물은 RNA가 성공적으로 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 또는 냉동 조직 4,7-9 중 하나에서 LCM에 의해 추출 될 수 있음을 보여 주었다. LCM-RNA 추출의 주요 과제는 R 1)을 정확하게 조직의 원하는 부분을 해부하고, 2) 보존하려면LCM 및 분리 공정 4,10 동안 NA의 무결성. 순수한 세포 집단에서 분리 된 RNA는 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에) 7,8, 마이크로 어레이 (11), 및 깊은 -sequencing 12-14 포함한 여러 방법에 의해 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수있다.
이 프로토콜의 목적은 하류 유전자의 발현 분석을 위해 냉동 된 조직으로부터의 LCM 전립선 상피 세포에서 총 RNA를 분리하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표본에서 인간 유전자 발현 프로파일 링이 가능 품질 또는 조직의 수량뿐만 아니라, 주어진 조직 표본에 존재하는 다양한 조직 학적 엔티티뿐만 아니라, 도전 일 수있다. 이것은 양성 조직은 주로 간질 조직 및 암 영역이다 기질 결여 된 전립선에 특히 도전적이다. LCM은 두 개의 서로 다른 유형의 세포 (도 1A)의 더 정확한 서명 전립선 상피와 기질 RNA의 물리적 분리를 용이하게한다. mac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
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