Introduction
与感兴趣的特定基因组区域相关联的分子的识别，需要理解的基因组功能，例如转录和表观遗传调控调节的机制。虽然几种技术已经开发了用于特定的基因组区域1-7中的生化分析，它们没有被广泛使用，因为其固有的问题，如有限的应用程序（例如，只对于高拷贝数或基因座基因座与重复），并在此阶段太多的时间和努力需要。
为了容易地执行特定的基因组区域的生化分析，我们已经开发了两种基因座特异性染色质免疫沉淀技术，即插入的ChIP（Internet控制器）8-13和工程化DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）14-17 。在Internet控制器，感兴趣的基因座是由标记的外源DNA结合蛋白如莱克斯插入识别序列答轨迹然后通过使用标记的DNA结合蛋白的亲和纯化分离。在enChIP，工程化DNA结合分子，如锌指蛋白，转录激活物状（TAL）的蛋白质，和群集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）配合物，用于标记的感兴趣位点（ 图1）。随后，将基因组区域被标记的DNA结合分子的亲和纯化分离。
之一的enChIP过Internet控制器的一个优点是，插入的外源DNA结合蛋白的识别序列是没有必要的。靶向使用CRISPR络合物选自Cas9（dCas9）的无催化活性的形式的和导向的RNA（gRNA）位点比这些区域通过Internet控制器或enChIP使用TAL和锌指蛋白靶向容易得多。这里，我们描述了一步一步的协议enChIP与质谱联用和RNA测序（RNA片段）识别位点Associa大泰德蛋白质和RNA的分别。
Protocol
工程DNA结合分子认识到目标轨迹的1.设计
- 对于使用CRISPR复合enChIP，使用CRISPRdirect网络工具（http://crispr.dbcls.jp），以确定所关注形容为先前18的基因组区域的候选gRNA靶序列。此Web工具将返回表格23 bp的基因组位点5'-N 20 NGG-3'的目标区域内。
- 合成一个gBlock包括U6启动子序列和5'- N 20中5'-N 20 NGG-3'使用商业服务的序列（ 见图 2）19,20。用于亚克隆的目的，包括gBlock以外适当的限制性酶位点。
- 插入gBlock到适当的载体如先前所述16。对于gBlocks几个逆转录病毒载体（请参阅材料 ）。
- 对于使用TAL蛋白enChIP，设计TAL蛋白识别TARG等位点。生成质粒编码使用商业服务TAL蛋白。产生含有稠合有一个或多个标记，如3×FLAG如前所述15的TAL蛋白质的表达载体。
2.建立细胞的enChIP分析
- 表达3×FLAG-dCas9和gRNA（CRISPR基于程序）或3×FLAG-TAL（TAL蛋白质基过程）在细胞中被如先前所描述的14-17进行分析。
- 使用瞬时转染，如果转染效率是高的。可含有3×FLAG-dCas9和CMV启动子的表达载体（ 见材料）。
- 考虑建立稳定的转化使用常规方法，如果瞬时转染效率是低的。除了 为gBlock上述逆转录病毒载体，是3×FLAG-dCas9的反转录病毒载体可用（ 参见材料）。
- 确认gRNA通过标准的RT-PCR法表达。
- 蛋白质与感兴趣的基因组区域相互作用的定量识别，可以考虑使用稳定同位素标记的通过在细胞培养物（SILAC）分析结合enChIP（enChIP-SILAC）氨基酸。
注：媒体的SILAC分析，可以从商业供应商处购买。 SILAC是在检测特异性相互作用强大。- 培养细胞SILAC重介质。准备细胞文化前进红色在SILAC光介质作为阴性对照。使用至少5×10 7个细胞的每个SILAC介质（重或轻）。为有效的标记，同时添加L-赖氨酸2HCl的，13 C 6和L-精氨酸盐酸，在SILAC重媒体13 C 6，15 N 4。注：至少有五细胞分裂所必需的标签蛋白。
- 例如，培养人纤维肉瘤HT1080细胞稳定表达3XFLAG-dCas9和gRNA在37℃和5％的CO 2在DMEM培养基SILAC和透析的胎牛血清与赖氨酸2HCl的加L-精氨酸盐酸（光介质）或13 C 6 L-赖氨酸二盐酸盐加13 C 6 15 N 4 L-精氨酸盐酸（重介质）（ 见材料）16。添加50毫克轻或重的L-赖氨酸-2HCl的和L-精氨酸盐酸在500毫升培养基中。
- Trypsinize和replate细胞才汇合，使细胞保持指数growtH。
- 培养细胞SILAC重介质。准备细胞文化前进红色在SILAC光介质作为阴性对照。使用至少5×10 7个细胞的每个SILAC介质（重或轻）。为有效的标记，同时添加L-赖氨酸2HCl的，13 C 6和L-精氨酸盐酸，在SILAC重媒体13 C 6，15 N 4。注：至少有五细胞分裂所必需的标签蛋白。
注意：这些标记的蛋白质的表达，也可以通过细胞内染色用抗FLAG-FITC和随后的FACS分析证实。一种协议，用于细胞内染色可以从我们的主页（http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html）下载。
3.交联细胞与甲醛
- 对细胞悬浮培养，转移2×10 7细胞表达3XFLAG-TAL蛋白质或3XFLAG-dCas9加gRNA和暂停在30ml常规培养基在50ml离心管中。当使用更多的细胞，提高试剂的数量和金额比例。对于SILAC实验，混合在重介质或光介质（各5×10 7个细胞）培养的细胞和1×10 8个细胞的总分为5试管含有2×10 7细胞。
- 添加810微升37％的甲醛的30毫升细胞悬浮液（最终浓度1％），并在37℃下5分钟。对于贴壁细胞，直接通过加入810微升37％的甲醛至30ml培养基中固定的细胞在培养皿中。
- 停止交联通过加入3.1毫升1.25M的甘氨酸溶液（最终浓度127毫摩尔），和在室温下孵育10分钟。
- 通过离心（300×g下5分钟，4℃）收集细胞。小心弃去上清液，包括甲醛，并将其存储在适当的废液瓶。
- 对于贴壁细胞，分离细胞用细胞刮刀和收获在50ml管中，并作为本步骤中所述收集细胞。
- 对于SILAC实验，混合在重介质或光介质（5×10 7个细胞每）培养分离的细胞，1×10 8个细胞的总分为5试管含有2×10 7细胞，并如在本描述的收集细胞步骤。
- 每管洗细胞沉淀用30ml的PBS两次。小心弃去上清液，包括甲醛，并根据化学品的安全指导方针将其存储在bottle.Handle甲醛废适当的废物。固定的细胞可以冷冻并储存于-80℃。
4.制备染色质（每2×107细胞 ）
- 暂停固定的细胞在10毫升细胞裂解缓冲液（10mM的Tris（pH 8.0）中，1毫摩尔EDTA，0.5％IGEPAL CA-630，和1×蛋白酶抑制剂），并在冰上孵育10分钟。
- 离心样品（830×g下在4℃，8分钟），小心弃去上清液。
- 暂停沉淀在10ml核裂解缓冲液（10毫摩尔Tris（pH值8.0），1mM EDTA中，0.5M氯化钠，1％的Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.5％月桂酰肌氨酸，和1x蛋白酶抑制剂）。冰上孵育10分钟，并涡旋振荡每2-3分钟。
- 离心样品（830× 在4℃，8分钟g），并小心地弃去上清液。
- 在10ml PBS中洗涤沉淀。将沉淀（染色质级分）可以储存在-80℃之后在液态氮立即冻结。
5.超声处理的染色质（每2×10 7细胞）
- 暂停在800微升的染色质部分改进的裂解缓冲液3（10毫摩尔Tris（pH值8.0），1mM EDTA中，150 mM氯化钠，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂），并转移到1.5ml试管。
- 超声处理使用超声波仪（参见材料）的染色质和条件如下：输出：3;税：100％（连续）;时间：自由。执行超声处理10-18个循环持续10秒和在冰上冷却20秒。为了避免过热，孵育样品在冰上2分钟，每5-6个周期。为了避免起泡，保持声处理探针0.5厘米管子的底部上方的尖端的位置。
- 离心样品（16,000×g下在4℃下进行10分钟），将上清转移到1.5ml试管。将超声处理的染色质可以储存在-80℃之后在液态氮立即冻结。
6.评估染色质碎片的
- 混合10微升片段化的染色质与85微升蒸馏水。
- 加入4微升和的5 M氯化钠孵育在65℃CO / N。
- 加入1微升10毫克/毫升RNA酶A和孵育在37℃下45分钟。
- 加入2微升的0.5M EDTA（pH 8.0）中，4微升的1M Tris（pH6.8）中，和1微升20mg / ml的蛋白酶K，再孵育在45℃下1.5小时。
- 单独的10微升样品通过电泳中不包含染色染料，如SYBR绿1％琼脂糖凝胶。
- 染色凝胶来评价零散染色质的长度的分布。产生0.5-2 kbp的（范围0.2-4千碱基对）的平均长度条件，推荐。
- 纯化通过苯酚-氯仿提取或通过使用DNA提取试剂盒（ 参见材料）从其余样品的DNA。将纯化的DNA可以作为输入的DNA来估计enChIP分析的产率（见8.11）。
7.制备磁珠共轭与抗体（每2×10 7细胞）
- 预削2 1.5 ml的管，一个用于使用正常小鼠IgG预澄清，另一个用于孵育抗FLAG抗体。添加150微升蛋白G偶联的磁珠（参见材料），以每管。
- 将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
- 暂停在1ml PBS中含有0.01％Tween-20（PBS-T）的珠。将管上的磁性底座，等待2分钟。弃去上清液吹打，然后重复步骤。
- 暂停在1ml含有0.1％BSA的PBS-T中的珠子。
- 加入15微克正常小鼠IgG或抗FLAG抗体和旋转4°CO / N。
- 后短暂离心，然后将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
- 暂停在1ml的PBS-T中的珠子。反转样品几次后短暂离心。将管上的磁体支架，等待3分钟，然后通过移液丢弃上清液。重复洗两次用PBS-T（总共三个洗涤步骤）。
8.染色质免疫沉淀（每2×10 7细胞）
- 混合在5.3中制备的分散的染色质）（约800微升）与五分之一体积的（大约200微升含5％的Triton X-100（1％的Triton X-100的最终浓度）改进的裂解缓冲液3）。
- 添加染色质溶液，以在其中结合有正常小鼠IgG蛋白G偶联的磁珠制备的管。旋转，在4℃下进行1小时。
- 将管上的磁体支架，等待3分钟。
- 将上清液转移到在其中结合有抗FLAG抗体蛋白G偶联的磁珠制备的管。旋转，在4°CO / N。
- 将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
- 暂停在1ml的低盐缓冲液（20mM的Tris（pH 8.0）中，2毫摩尔EDTA，150毫摩尔NaCl，1％三珠吨X-100，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂），并旋转，在4℃下5分钟。将管上的磁体支架，等待3分钟。弃上清，吹打，重复清洗步骤。
- 洗用高盐缓冲液（20mM的Tris（pH 8.0）中，2毫摩尔EDTA，500毫摩尔NaCl，1％的Triton X-100，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂）的两倍珠。
- 洗用的LiCl缓冲液（10mM的Tris（pH 8.0）中，1毫摩尔EDTA，250毫的LiCl，0.5％IGEPAL CA-630，0.5％脱氧胆酸钠，和1x蛋白酶抑制剂）的两倍珠。
- 洗用TBS-IGEPAL CA-630（50毫摩尔Tris（pH值7.5），150 mM氯化钠，0.1％IGEPAL CA-630，和1x蛋白酶抑制剂）一旦珠。
- 暂停在200μl洗脱缓冲液的珠（50毫摩尔Tris（pH值7.5），150 mM氯化钠，0.1％IGEPAL CA-630，1×蛋白酶抑制剂，和500微克/毫升3×FLAG肽）和在37℃下20分钟。将管上的磁体支架，等待3分钟。将上清液转移到一个新的1.5毫升管，并重复ELUT离子一步。
- 净化洗脱液通过苯酚-氯仿提取或通过使用DNA提取试剂盒的DNA小部分（例如，5％）（见材料）。将纯化的DNA可用于PCR用特定引物集来估计产量enChIP分析由与如先前14,16所述制备步骤6.7输入的DNA进行比较。
9. SDS-PAGE，染色，质谱分析
- 混合洗脱物（400微升）用1毫升2-丙醇，加入50μl3M乙酸钠（pH 5.2）和5微升20毫克/毫升糖原。沉淀的染色质在-20℃CO / N。
- 离心样品（16,000×g下在4℃下30分钟）并弃去上清液。冲洗用1ml 70％乙醇，离心再次的粒料（16,000×g下在4℃下进行10分钟）。吹打完全弃上清。
- 暂停在40微升2×样品缓冲液（125毫摩尔Tris（pH6.8）中，10％的2-MERC沉淀aptoethanol，4％SDS，10％蔗糖和0.004％溴酚蓝）。涡旋5分钟，以完全溶解沉淀，然后孵育在100℃下30分钟以变性蛋白和逆转交联。
- 对于SDS-PAGE凝胶上的运行40微升样品直至染料达到1厘米以下的井。注意：我们通常使用4-20％梯度凝胶，但其他％凝胶可以使用。
- 染色用考马斯亮蓝或银染的凝胶。
- 切胶成五片（2 mm高）。
- 如先前13-16说明进行凝胶消化和质谱分析。
- 对于SILAC实验用5×10 7个细胞每（总共1×10 8个细胞），从最初的5管在40微升2×样品缓冲液（这是没有必要按比例增加）暂停粒料。
10.纯化RNA和RNA测序分析
- 为了净化enChIP后的RNA，加酶抑制剂的5单位/毫升（SEë材料），以所有的缓冲溶液，除改进的裂解缓冲液3和洗脱缓冲液中，向其中添加RNA酶抑制剂的40单位/毫升。
- 混合洗脱物（400微升），16微升的5M NaCl和孵育在65℃下2小时。
- 加入1毫升酸 - 胍 - 酚系试剂（参见材料）到样品中。涡旋15秒，然后在室温下孵育5-15分钟。离心样品15分钟，12000×g下和室温。
- 上清转移到一个新的1.5毫升管，加入5微升对溴苯甲醚的。涡旋15秒，然后在室温下孵育3-5分钟。离心样品以12,000×克和RT 10分钟。
- 转移上清液（约1毫升）到新的2ml管中，加入1毫升2-丙醇。倒置该管并在室温下孵育10分钟。装载到混合物中的RNA纯化试剂盒的柱（ 参见材料）。离心列在12000×1分钟 G和RT。
- 洗用400μl的RNA洗涤缓冲液中的RNA纯化试剂盒（参见材料）的列。
- 的5微升DNA酶I（1U /微升），8微升10×DNA酶I反应缓冲液，3微升DNA酶/无RNase水，和64微升的RNA洗涤缓冲液中添加80μl的DNA酶I的鸡尾酒（混合物的RNA纯化试剂盒（参见材料））到柱上。孵育样品在37℃下进行15分钟，然后在12000×g下和RT离心30秒。
- 用400微升RNA预洗缓冲液中的RNA纯化试剂盒（见材料）的两倍洗列。
- 洗脱用50μlDNA酶/无RNase水的核糖核酸。将洗脱的RNA可用于RNA测序。
Representative Results
总体而言，靶基因组区域的1-30％可使用enChIP纯化。 图3包括代表数据表示enChIP的产率分析靶向端粒和干扰素（IFN）调节因子1（IRF-1）基因的启动子。作为典型的结果，表1列出实施例与在IRF-1启动子中鉴定由enChIP-SILAC， 表一的IFNγ特异性方式相关的蛋白2列出确定enChIP与质谱联用端粒结合蛋白（enChIP-MS） ，和表3列出用确定enChIP-RNA测序端粒相关联的的RNA。
图 enChIP 1.概述 。 enChIP使用CRISPR（A，B）和 TAL（C，D，E 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.序列gBlock的。U6启动子（黑色），对G核苷酸b安伏的导向序列（蓝色），引导序列（gRNA间隔物）（红色），所述支架序列（绿色），及终止子序列（橙色）被示出。
图3.产量的代表enChIP分析 。 （A）中的百分比的输入为目标的IRF-1基因座和非靶Sox2的基因座。 （B）的百分比的输入为目标端 粒和非目标γ-卫星。该数字已调整，并从以前的出版物15,16修改。
| 分类 | 蛋白质 |
| 转录 | DDX1，PARP1，CKAP4，Pescadillo同源，PURβ， 活化的RNA聚合酶II转录激活p15基因， BTF3，Myb的结合蛋白1A |
| 组蛋白脱乙酰化， 辅阻遏物成分 | RBBP4，PA2G4，TBL3 |
| 乙酰转移酶 | 蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1 |
| DNA拓扑异构酶 | DNA拓扑异构酶2α |
| 组蛋白 | 组蛋白H2A.Z，组蛋白H3.2 |
表1：用 在确定enChIP-SILAC一个IFNγ特异性方式的人IRF-1的启动子区相关的蛋白质的例子的表已被改编从先前的出版物16。
| 分类 | 蛋白质 |
| 哺乳动物端粒结合蛋白 | PML，RPA，CDK1，PARP1，PCBP1 |
| 端粒碧在酵母nding蛋白质 或其他生物 | IMP4 |
| 与蛋白质相互作用的端粒结合 蛋白质[相关端粒结合蛋白] | DNA聚合酶α（POLA1）Cdc13p] ARMC6 [TRF2]，CTBP1 [FOXP2-POT1] exportin-5 [叔]，GNL3L [TRF1] exportin-1 [叔]，14-3-3 [叔] |
| 蛋白定位于异 | BEND3 |
| 蛋白质调控的表观遗传标记 | KDM5C |
| 蛋白质的突变影响端粒功能 | DNA聚合酶α（POLA1），HAT1，Nup133， CDK7，DPOE1，PRDX1，TYSY， 谷氨酸半胱氨酸连接酶，谷，SMRC1 |
表2：用 确定enChIP-MS鼠标端粒相关蛋白的例子表已adapted从以前的出版物15。
| 分类 | RNA的 |
| 端粒酶组件 | TERC，RMRP |
| 端粒的RNA | TERRAS |
| scaRNAs | Scarna6，Scarna10，Scarna13，Scarna2 |
| H / ACA 52]形成 | Snora23，Snora74a，Snora73b，Snora73a |
| C / D 52]形成 | Snord17，Snord15a，Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
表3： 具有确定enChIP-RNA的序列表已被改编自先前公布17 鼠标端粒相关的RNA的例子 。
Acknowledgments
这项工作是由武田科学基金会（TF）的支持;旭硝子基金会;上原纪念基金会（HF）;在仓田纪念日立科学技术基金会（TF和HF）;格兰特提供的援助青年科学家（B）（＃25830131），格兰特 - 在急救科学研究（C）（＃15K06895）（TF）;和格兰特 - 在急救科学研究的创新领域“转录周期”（＃25118512＆＃15H01354），格兰特 - 在急救科学研究（B）（＃15H04329），格兰特提供的援助的探索性研究（ ＃26650059）和“基因组支持”（＃221S0002）（HF）由教育部，文化，体育，科学和技术的日本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
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