Introduction
Идентификация молекул, связанных с конкретными геномных областей, представляющих интерес необходимо для понимания механизмов регулирования геномных функций, таких как транскрипции и эпигенетической регуляции. Хотя несколько методов были разработаны для биохимического анализа конкретных областей генома 1-7, они широко не используется на этой стадии, потому что присущих им проблем, таких как ограниченное применение (например, только для высокого числа копий локусов или локусов с повторами) и слишком много времени и усилий требуется.
Для того, чтобы выполнить биохимический анализ конкретных областей генома легко, мы разработали два локуса конкретных иммунопреципитации хроматина (чип) технологий, а именно инсерционный чип (iChIP) 8-13 и инженерии ДНК-связывающего молекулы ChIP-опосредованной (enChIP) 14-17 , В iChIP, локус интереса помечены вставки последовательностей распознавания экзогенного ДНК-связывающего белка, такие как LexА. Локус затем выделяют с помощью аффинной очистки с использованием меченый ДНК-связывающий белок. В enChIP, инженерные ДНК-связывающие молекулы, такие как цинк-пальцевых белков, транскрипции активаторов, как (TAL) белков, и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) комплексы, которые используются, чтобы пометить локус интерес (Рисунок 1). Впоследствии геномной области выделяют аффинной очистки меченых молекул в ДНК-связывающих.
Одним из преимуществ над enChIP iChIP, что введение последовательности узнавания экзогенного ДНК-связывающего белка не является необходимым. Ориентация локусов, используя CRISPR комплексы, состоящие из каталитически неактивной формы Cas9 (dCas9) и руководство РНК (gRNA) гораздо проще, чем таргетинг этих регионах по iChIP или enChIP использованием TAL и цинк-пальцев белки. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол enChIP в сочетании с масс-спектрометрии и секвенирования РНК (РНК-Seq), чтобы определить локус-AssociaTed белки и РНК, соответственно.
Protocol
1. Проектирование инженерии ДНК-связывающих молекул признавая локуса-мишени
- Для enChIP использованием CRISPR комплексы, использовать CRISPRdirect веб-инструмент (http://crispr.dbcls.jp) для определения кандидата gRNA последовательности-мишени в геномной области интереса, как описано ранее 18. Этот веб-инструмент возвращает 23 б.п. геномных участков виде 5'-N 20 NGG-3 »в рамках целевой области.
- Синтезировать gBlock включая U6 промоторной последовательности и последовательность 5'-N 20 в 5'-N 20 NGG-3 ', используя коммерческие услуги (рис 2) 19,20. Для целей субклонированием, включать в себя соответствующие сайты рестрикции пределами gBlock.
- Вставьте gBlock в соответствующий вектор, как описано выше 16. Несколько ретровирусные векторы для gBlocks доступны (см Материалы).
- Для enChIP использованием TAL белки, дизайн TAL белки, распознающие Тарги др локусов. Создание плазмиды, кодирующие белки TAL, используя коммерческие услуги. Генерирование векторов экспрессии, содержащих белки, слитые TAL с одним или несколькими метками, такими как 3 × FLAG, как описано выше 15.
2. Установление клеток для анализа enChIP
- Экспресс 3 × FLAG-dCas9 и gRNA (процедура CRISPR основе) или 3 × FLAG-ТАЛ (процедура на основе белков TAL) в клетках, которые будут проанализированы, как описано выше 14-17.
- Использование временной трансфекции, если эффективность трансфекции является высокой. Вектор экспрессии, содержащий 3 × FLAG-dCas9 и промотор CMV доступно (см Материалы).
- Рассмотреть вопрос о создании стабильных трансформантов с использованием обычных методов, если переходный эффективность трансфекции является низким. В дополнение к вышеупомянутым ретровирусных векторов для gBlock, ретровирусные векторы 3 × FLAG-dCas9 доступны (см Материалы).
- 14-17.
Примечание: Экспрессия этих белков также помечены может быть подтверждено окрашиванием внутриклеточных анти-FLAG-FITC и последующего анализа FACS. Протокол внутриклеточного окрашивания может быть загружен с нашего сайта (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). - Подтвердите выражение gRNA по стандартной методике RT-PCR.
- Для количественного определения белков, взаимодействующих с геномной области интереса, рассмотреть возможность использования стабильного изотопа в аминокислотами в культуре клеток (SILAC) анализа в сочетании с enChIP (enChIP-SILAC).
Примечание: Медиа для анализа SILAC можно приобрести у коммерческих поставщиков. SILAC является мощным в выявлении конкретных взаимодействий.- Культура клеток в среде SILAC тяжелой. Подготовка клетки cultuкрасный SILAC света среде в качестве отрицательного контроля. Используйте по крайней мере 5 × 10 7 клеток для каждого SILAC среды (тяжелой или легкой). Для эффективного маркировки, добавить как L-лизин-2HCl, 13 C 6 и L-аргинин-HCl, 13 C 6, 15, N 4 в СМИ SILAC тяжелым. Примечание: По крайней мере, пять клеточных делений необходимы для белков этикеток.
- Например, культура человека фибросаркомы клетки НТ1080, стабильно экспрессирующие 3xFLAG-dCas9 и gRNA при 37 ° С и 5% СО 2 в DMEM средств массовой информации для SILAC и диализовали эмбриональной бычьей сыворотки с лизин-2HCl плюс L-аргинин-HCl (Свет среде) или 13 С 6 L-лизин-2HCl плюс 13 С 6 15 N 4 L-аргинин-HCl (Тяжелая среда) (см Материалы) 16. Добавить 50 мг легкой или тяжелой L-лизин-2HCl и L-аргинина-НСl в 500 мл среды.
- Trypsinize и replate клетки, прежде чем они сливаются, так что клетки сохраняют экспоненциальный growtчас
- Культура клеток в среде SILAC тяжелой. Подготовка клетки cultuкрасный SILAC света среде в качестве отрицательного контроля. Используйте по крайней мере 5 × 10 7 клеток для каждого SILAC среды (тяжелой или легкой). Для эффективного маркировки, добавить как L-лизин-2HCl, 13 C 6 и L-аргинин-HCl, 13 C 6, 15, N 4 в СМИ SILAC тяжелым. Примечание: По крайней мере, пять клеточных делений необходимы для белков этикеток.
3. Сшивание клеток с формальдегидом
- Для клеток в суспензионной культуре, передачи 2 × 10 7 клеток, экспрессирующих 3xFLAG-TAL белки или 3xFLAG-dCas9 плюс gRNA и приостановить в 30 мл обычной культуральной среде в 50 мл центрифужную пробирку. Когда больше используют клетки, увеличение объемов и количество реагентов пропорционально. Для SILAC экспериментов, смешать клеток, культивируемых в среде тяжелой или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом) и разделить в общей сложности 1 х 10 8 клеток в пробирки, содержащие 5 2 х 10 7 клеток.
- Добавить 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл клеточной суспензии (конечная концентрация 1%), и инкубировали при 37 ° С в течение 5 мин. Для адгезивных клеток, непосредственно исправить клеток в культуральные чашки, добавив 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл культуральной среды.
- Остановка сшивание добавлением 3,1 мл 1,25 М раствора глицина (конечная концентрация 127 мМ), аинкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Собирают клетки центрифугированием (300 × г в течение 5 мин при 4 ° С). Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем бутылки отходов.
- Для адгезивных клеток, отделить клетки с клеточным скребком и урожая в 50 мл пробирку, и клетки собирают, как описано в данном шаге.
- Для SILAC экспериментов, смешать отдельные клетки культивировали в тяжелой среде или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом), разделить общей сложности 1 × 10 8 клеток в 5 пробирок, содержащих 2 х 10 7 клеток, и собрать клетки, как описано в этом шаг.
- Промыть осадок клеток с 30 мл PBS на пробирку дважды. Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем отходов bottle.Handle формальдегида отходы в соответствии с руководящими принципами химических безопасности. Фиксированные клетки могут быть заморожены и хранили при -80 ° С.
4. Подготовка хроматина (за 2 х 107 клеток)
- Приостановка фиксированные клетки в 10 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5% IGEPAL СА-630 и 1 × ингибиторов протеазы) и инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Центрифуга образец (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант.
- Приостановка осадок в 10 мл лизирующего буфера ядерного (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,5% лауроилсаркозин и ингибиторы протеазы 1x). Инкубируют на льду в течение 10 мин и вихревых каждые 2-3 мин.
- Центрифуга образца (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант.
- Промыть гранулу в 10 мл PBS. Осадок (хроматина фракции) может быть хранили при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте.
5. ультразвуком хроматина (за 2 х 10 7 клеток)
- Приостановить хроматина фракции в 800 мклмодифицировано буфера для лизиса 3 (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и передать в 1,5 мл пробирку.
- Разрушать ультразвуком хроматина с помощью ультразвукового (см Материалы) и следующие условия: Выход: 3; обязанность: 100% (непрерывный); и время: бесплатно. Выполнение 10-18 циклов обработки ультразвуком в течение 10 сек и охлаждении на льду в течение 20 сек. Чтобы избежать чрезмерного нагрева, инкубировать образцы на льду в течение 2 мин через каждые 5-6 циклов. Чтобы избежать вспенивания, сохранить положение кончика зонда обработки ультразвуком 0,5 см выше нижней части трубы.
- Центрифуга образца при (16000 × г при 4 ° С в течение 10 мин) и супернатант передачи в 1,5 мл пробирку. Озвученную хроматина можно хранить при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте.
6. Оценка хроматина фрагментации
- Смешайте 10 мкл фрагментированной хроматина с 85 мкл дистиллированной воды.
- Добавьте 4 мкл5 М NaCl и инкубировать при 65 ° CO / N.
- Добавить 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
- Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 4 мкл 1 М Трис (рН 6,8), и 1 мкл 20 мг / мл протеиназы К, а затем инкубируют при 45 ° С в течение 1,5 ч.
- Отдельные 10 мкл образца с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, который не содержит окрашенные красители, такие как SYBR Green.
- Пятно гель оценить распределение длин фрагментированной хроматина. Условия, которые генерируют среднюю длину 0,5-2 кб (диапазон 0,2-4 кб) рекомендуется.
- Очищают ДНК из остальных образцов по экстракции фенолом и хлороформом или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать в качестве входного ДНК оценить выход enChIP анализов (см 8.11).
7. Подготовка Dynabeads сопряженных с антителами (за 2 х 10 7 клеток)
- Заранеечистить два 1,5 мл трубки, один для предварительной очистки с помощью обычного IgG мыши, а другой для инкубации с анти-FLAG Ab. Добавить 150 мкл белка G-сопряженных магнитных шариков (см Материалы) в каждую пробирку.
- Поместите трубки на магнит стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
- Приостановка бусины в 1 мл PBS, содержащий 0,01% Твин-20 (PBS-T). Поместите трубки на магнитной подставке и ждать в течение 2 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки, а затем повторите этот шаг.
- Приостановка бусины в 1 мл PBS-T, содержащем 0,1% БСА.
- Добавить 15 мкг нормальной IgG мыши или анти-FLAG Ab и вращаются на 4 ° CO / N.
- Спин вниз кратко, то поместите пробирки на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
- Приостановить бисером в 1 мл PBS-T. Обратить образец несколько раз, и спин вниз кратко. Место труб на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин, а затем отбросить супернатант с помощью пипетки. Повторите мытьеще два раза с PBS-T (общее из трех стадий промывки).
8. хроматина Иммунопреципитация (за 2 х 10 7 клеток)
- Смешайте фрагментированный хроматин, полученного в 5.3) (приблизительно 800 мкл) с одной пятой объема (примерно 200 мкл) модифицированного буфера для лизиса 3, содержащей 5% Triton X-100 (конечная концентрация 1% Тритон Х-100).
- Добавьте хроматина решение трубки, в которой протеин G-конъюгированные магнитные шарики, конъюгированные с нормальной мыши IgG были получены. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа.
- Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин.
- Перенести супернатант в трубку, в которой белок G-сопряженные магнитные шарики, сопряженные с анти-FLAG Ab были подготовлены. Поворот при 4 ° CO / N.
- Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки.
- Приостановка бусины в 1 мл буферного раствора с низким (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% тройногот Х-100, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и вращать при 4 ° С в течение 5 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки и повторить стадии промывки.
- Промыть шарики с высоким содержанием соли буфера (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,1% SDS, и 1x ингибиторов протеазы) дважды.
- Промыть шарики с LiCl-буфере (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 250 мМ LiCl, 0,5% IGEPAL СА-630, 0,5% дезоксихолат натрия, и ингибиторы протеазы 1x) дважды.
- Промыть шарики с TBS-IGEPAL СА-630 (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, и ингибиторы протеазы 1x) один раз.
- Приостановка бусины в 200 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, 1x ингибиторы протеазы и 500 мкг / мл 3 × FLAG пептид) и инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и повторить Elutионная шаг.
- Очищают ДНК из небольшой части (например, 5%) элюата путем экстракции фенол-хлороформ или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать для ПЦР с наборами праймеров конкретных оценить выходы enChIP анализ по сравнению с входным ДНК, полученной на стадии 6.7, как описано ранее 14,16.
9. SDS-PAGE, окрашивания и анализа Масс-спектрометрический
- Смешайте элюата (400 мкл) с 1 мл 2-пропанола, 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2), и 5 мкл 20 мг / мл гликогена. Осадок хроматина при -20 ° CO / N.
- Центрифуга образец (16000 × г при 4 ° С в течение 30 мин) и отбросить супернатант. Промыть гранулу с 1 мл 70% -ного этанола и центрифугируют снова (16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин). Удалите супернатант полностью с помощью пипетки.
- Приостановка осадок в 40 мкл 2x буфера для образца (125 мМ Трис (рН 6,8), 10% 2-Mercaptoethanol, 4% ДСН, 10% сахароза и 0,004% бромфенолового синего). Вихревые в течение 5 мин для полного растворения осадка, а затем инкубируют при температуре 100 ° С в течение 30 мин для денатурации белков и обратной сшивки.
- Для SDS-PAGE, запустить 40 мкл образца на гель, пока краситель не достигнет 1 см ниже скважины. Примечание: Обычно мы используем 4-20% градиентные гели, но и другие гели% могут быть использованы.
- Пятно гель кумасси бриллиантовым голубым или серебром.
- Вырезать гель на пять частей (2 мм высоты).
- Выполните в гелевой пищеварения и масс-спектрометрического анализа, как описано ранее 13-16.
- Для SILAC экспериментов с 5 х 10 7 клеток друг (всего 1 х 10 8 клеток), приостановить осадок от первых пяти трубок в 40 мкл 2x буфера для образца (не нужно наращивать).
10. Очистка РНК и РНК-Seq анализа
- Для очистки РНК после enChIP, добавляют 5 ЕД / мл РНКазы ингибитора (SEе) материалы на все буферных растворов, кроме модифицированного буфера для лизиса 3 и буфер для элюции, к которому добавить 40 ед / мл РНКазы ингибитора.
- Смешайте элюата (400 мкл) с 16 мкл 5 М NaCl и инкубируют при 65 ° С в течение 2 ч.
- Добавить 1 мл кислоты гуанидиния-фенола на основе реагента (см Материалы) к образцу. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5-15 мин. Центрифуга образца в течение 15 мин при 12000 г и КТ.
- Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и добавляют 5 мкл р-броманизола. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 мин. Центрифуга образца в течение 10 мин при 12000 г и КТ.
- Передача супернатант (приблизительно 1 мл) в новую пробирку 2 мл и добавляют 1 мл 2-пропанола. Переверните пробирку и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Загрузите смеси на колонке в комплекте очистки с РНК (см Материалы). Центрифуга колонку в течение 1 мин при 12000 г и РТ.
- мытьстолбец с 400 мкл промывочного буфера РНК в комплект очистки с РНК (см Материалы).
- Добавить 80 мкл ДНКазы I коктейль (смесь 5 мкл ДНКазы I (1 ед / мкл), 8 мкл 10 × ДНКазы I реакционного буфера, 3 мкл ДНКазы / РНКазы воды и 64 мкл РНК промывочного буфера в системой очистки РНК комплект (см Материалы)) на колонке. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 15 мин, а затем центрифуги в течение 30 сек при 12000 х г и КТ.
- Промыть колонку с 400 мкл РНК Предварительная стирка буфера в комплект очистки с РНК (см Материалы) дважды.
- Элюции РНК с 50 мкл ДНКазы / РНКазы воды. Элюированный РНК могут быть использованы для РНК последовательности.
Representative Results
В целом, 1-30% целевых областей генома может быть очищен с помощью enChIP. Рисунок 3 включает в себя представительные данные, показывающие выход enChIP анализ ориентации теломеры и промотор интерферона (ИФН) регуляторного фактора-1 (IRF-1) гена. В качестве примеров типичных результатов, таблица 1 перечисляет белки, связанные с IRF-1 промоутера в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC, таблица 2 перечислены теломер-связывающие белки, определенные enChIP в сочетании с масс-спектрометрии (enChIP-МС) и таблице 3 приведены РНК, связанные с теломер, определенных enChIP-РНК-Seq.
Рисунок 1. Обзор enChIP. enChIP помощью CRISPR (A, B) и Таль (С, D, Е сильный>) показано. Локус интерес помечен инженерных молекул ДНК-связывающий такой как белок TAL или CRISPR системы, состоящей из каталитически неактивной формы Cas9 (DCAS) и направлять РНК (gRNA). Молекулярные взаимодействия фиксируются с формальдегидом или другими сшивающими агентами, если это необходимо. Впоследствии, фиксированная хроматин фрагментирован с помощью ультразвука или ферментативного пищеварения. Маркированные геномные области очищают аффинной очистки. Наконец, сшивка вспять, и взаимодействующие молекулы (геномные регионы, РНК и белки) идентифицируются при помощи следующего поколения секвенирования и масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Последовательность gBlock. Метро U6 промотор (в черном), Г нуклеотид бEfore последовательность руководство (в синем), руководство последовательность (gRNA спейсер) (в красном), последовательность леса (зеленый цвет), и последовательность терминатора (оранжевым цветом) показаны.
Рисунок 3. Урожайность представителя enChIP анализов. (A) в процентах входы для цели IRF-1 локуса и нецелевого Sox2 локуса. (Б) процент входы для целевых теломер и нецелевых гамма-спутников. Цифры были адаптированы и изменены от предыдущих изданий 15,16.
Категории | Белки |
Транскрипция | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo гомолог, PURβ, активируется РНК-полимераза II транскрипции активатор р15, BTF3, Myb связываниябелок 1A |
Гистонов деацетилирование, компоненты корепрессора | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
Ацетилтрансфераза | Белок аргинин N-метилтрансферазы 1 |
Топоизомеразы ДНК | ДНК топоизомеразы 2α |
Гистоны | Гистонов H2A.Z гистонов H3.2 |
Таблица 1:. Примеры белков, связанных с человеческим IRF-1 промоторной области в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 16.
Категории | Белки |
Млекопитающих теломер-связывающие белки | ПМЛ, РПА, CDK1, PARP1, PCBP1 |
Теломер-бидача белки у дрожжей или другие организмы | IMP4 |
Белки, взаимодействующие с теломер-связывающего белки [связанные теломер-связывающий белок] | ДНК-полимераза α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-РОТ1], Exportin-5 [трет], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [трет], 14-3-3 [трет] |
Белки локализующие для гетерохроматина | BEND3 |
Белки регулирования эпигенетические | KDM5C |
Белки, чьи мутации затрагивают функцию теломер | ДНК-полимеразы α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, глутамат-цистеин лигазы, глутаредоксин, SMRC1 |
Таблица 2:. Примеры белков, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-МС стол был ADAPTEd из предыдущей публикации 15.
Категории | РНК |
Компоненты теломеразы | TERC, Rmrp |
Теломерной РНК | Террас |
scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
Н / АСА snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
lncRNA | Neat1 |
Таблица 3: Примеры РНК, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-РНК-Seq Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 17..
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Takeda научного фонда (TF); Асахи Стекло Фонд; Мемориал Фонд Уэхара (ВЧ); Kurata Мемориал Hitachi Наука и техника фонд (ТФ и ВЧ); Грант-в-помощь для молодых ученых (B) (# 25830131), Грант-в-помощь по научным исследованиям (C) (# 15K06895) (TF); и Грант-в-помощь для научных исследований в "Транскрипция цикла 'инновационных направлений (# 25118512 & # 15H01354), Грант-в-помощь для научных исследований (B) (# 15H04329), Грант-в-помощь для поисковых исследований ( # 26650059) и «Геном поддержки" (# 221S0002) (ВЧ) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).