인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.
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방법 논문
생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는
이 논문에서
요약
초록
Enhancers는 위치 및 방향에 독립적인 방식으로 조직 특이적 유전자 발현을 조절하여 세포 정체성을 제어합니다. 이러한 인핸서(enhancer)는 종종 유전자 간 영역(intergenic region)에서 조절되는 유전자로부터 멀리 떨어져 있거나 심지어 다른 유전자의 몸체 내에 위치합니다. 인핸서 활성의 위치 독립적 특성으로 인해 인핸서를 조절하는 유전자와 일치시키는 것이 어렵습니다. 인핸서 영역의 결실은 인핸서 활성에 대한 직접적인 증거를 제공하며 내인성 유전자 전사에서 인핸서의 역할을 밝히는 황금 표준입니다. 기존의 상동 재조합 기반 결실 방법은 최근 게놈 편집 기술의 발전으로 능가되어 수많은 모델 유기체의 게놈에 대한 빠르고 정확한 위치 변경을 가능하게 합니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집은 맞춤형 발현 플라스미드의 가이드 RNA에 의해 Cas9을 게놈으로 쉽게 표적화할 수 있기 때문에 많은 세포 유형 및 유기체의 게놈을 빠르고 비용 효율적으로 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 필수 유전자 조절 요소의 동형접합적 결실은 치사를 유발하거나 세포 표현형을 변화시킬 수 있는 반면, 전사 강화제의 단일대립유전자 결실은 이러한 혼란스러운 문제 없이 유전자 발현의 시스 조절을 연구할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 F1 마우스 배아 줄기(ES) 세포(Mus musculus129 x Mus castaneus)에서 CRISPR/Cas9 매개 결실에 대한 프로토콜입니다. 단일대립유전자 결실, 스크리닝 및 발현 분석은 두 대립유전자 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 의해 촉진되며, 이 세포에서 평균 125bp마다 발생합니다.
서론
전사 조절 요소에 의한 비정상적인 유전자 발현이 질병을 초래할 수있다 이러한 요소 개발 1 변형시 유전자 발현 시공간 미세 조정이 중요하다. 게놈 넓은 협회 연구에 의해 확인 된 많은 질병 관련 지역 비 코딩 지역에 있고 전사 증강 3-4의 기능을 가지고 있습니다. 강화제를 파악하고 그들이 자주 몇 킬로베이스 거리가 조절하는 유전자의 위치와 조직 - 특이 적 방식으로 5-6으로 활성화 될 수 있으므로 복잡 조절하는 유전자로 일치. 증강 예측은 일반적으로 히스톤 수정 마크, 중재자-cohesin 단지를 기반으로 세포 유형 특정 전사의 결합은 7-10 요인 있습니다. 예측 증강의 유효성 검사는 가장 자주 인핸서는 리포터 유전자 11 ~ 12의 발현을 활성화하는 벡터 기반의 분석을 통해 이루어집니다. 이러한 데이터는 V를 제공추정 인핸서 서열의 규제 가능성에 대한 aluable 정보는하지만 자신의 내생 게놈 맥락에서 그 기능을 공개하거나 조절하는 유전자를 식별하지 않습니다. 게놈 편집 기능 상실 분석에 의해 자신의 내생 적 맥락에서 전사 조절 인자의 기능을 연구하는 강력한 도구 역할을한다.
게놈 편집, 즉 CRISPR / Cas....
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프로토콜
1. 설계 및 gRNA를 구축
- 전사 인핸서 영역이 gRNAs, 관심 영역 중 하나 5 '하나 3'을 사용하여 삭제합니다. (http://www.genome-engineering.org 15) 고유 gRNA 시퀀스를 식별하기 위해 장 기관에 의해 발생 된 마우스 UCSC 게놈 브라우저 트랙을 사용한다. 다음이 gRNAs와 생거 연구소 (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27 ~ 28에서 제공하는 온라인 도구를 사용하여 SNP를하고 삽입과 삭제에 대한 자신의 인접 PAM을 확인합니다. 동일한 효율로 두 대립 유전자를 대상으로하기 위해, SNP 또는 INDEL를 포함 gRNA / PAM 시퀀스를 피할 수 있습니다.
- gRNA을 선택하는 동안, 삭제를 유전형에 대한 대립 유전자 특이 적 프라이머를 설계의 타당성을 확인합니다. 대립 유전자 특이 프라이머 디자인 (5)을 참조하십시오.
- 말리 등. 2013 15에 기술 된 프로토콜에 따른 두 gRNA 플라스미드를 조립한다. 선택한 독특한 20 bp의 표적 서열 INT를 통합표 7에 나타낸 바와 같이 61mer 올....
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결과
여기에 설명 된 프로토콜 CRISPR / Cas9 게놈 편집 (도 1)를 이용하여 생성 monoallelic 인핸서 삭제 세포에서 유전자 발현의 시스 -regulation 공부 F1 ES 세포를 사용한다. 유전자형 유전자 발현의 gRNA 및 대립 유전자 특이 적 프라이머를 디자인이 방법에서 중요한 요소이다. 각 대립 유전자 특이 프라이머 세트는 대립 유전자 특이성을 확인하는 qPCR에 의해 검증되어야합니다. 그들의 각각의 게놈 DNA 목표를 증폭 대립 유전자 특이 적 프라이머 (그림 2)에 이상적이다. 이상적으로 이러한 프라이머는 3 '끝에 SNP가 있습니다. 그들이 잘못 유전자형 25 대 정확한 그들의 증폭 5 코네티컷 값 차이의 최소 표시하면 이하 대립 유전자 - 특이 프라이머가 사용될 수있다. 이상 5 '말단에서 3에서 4 번째 염기보다'.......
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토론
CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집 기술은 게놈 수정에 대한 간단 빠르고 저렴한 방법을 제공한다. 기능 증강 특성에 대한 monoallelic 증강 삭제를 생성하고 분석하기 위해 여기에 설명 된 방법은 F1 마우스 세포에서 SNP를 활용합니다. 이러한 유형의 접근법의 이점은 : 1) monoallelic 인핸서 삭제가 중요한 증강제, 즉 두 대립 유전자에서 치사 셀에 이르는 조절 유전자의 단백질 수준에서 큰 감소를 삭제하거나 변경 될 때 발생하는 교란 효과를 생성하지 표현형; 2) monoallelic 삭제 주파수가 동형 접합 결실을 얻기 어렵다 낮은 경우; 그러나, 유전자 발현 분석에서의 대립 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 하나는 monoallelic 결실 클론을 분석 할 수있다; 3) monoallelic 삭제를 선별 프라이머의 4 세트를 사용하면 혼동 부분 또는 대형 삭제를 포함하는 클론의 제거를 허용다운 스트림 분석.
대립 유전자 특이 적 프.......
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공개 사항
저자는 이해 충돌에 조브의 정책을 읽고 공개 충돌이 더이 없다.
감사의 글
유익한 토론을 해주신 Mitchell 연구실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research), 캐나다 혁신 재단(Canada Foundation for Innovation) 및 온타리오 연구 혁신부(Ontario Ministry of Research and Innovation)의 지원을 받았습니다(JAM이 보유한 운영 및 인프라 보조금).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | gRNA 어셈블리에 사용되는 고충실도 DNA 중합효소 |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | 타겟 염기서열을 이 벡터에 클로닝하여 |
| Addgene | 44719 | Codon에 최적화된 SpCas9 및 EGFP pCas9_GFP gRNA plasmid를 생성합니다. 동시 발현 플라스미드 | |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| 네온 형질주입 시스템 100 &마이크로; L Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator 형질주입 기술 |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | 게놈 DNA 추출 시약 |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| 고속 플라스미드 미니 키트 | Geneaid | PD300 | |
| 맥시 플라스미드 키트 내독소 무료 | PME25 | ||
| SYBR 선택 믹스 | |||
| iScript cDNA 합성 키트 | Bio-rad | 170-8891 | 역전사 시약 |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell 인증 | FBS는 마우스 ES 세포에서 다능성 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| 밀봉 테이프 | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | 무알코올 세포 동결 용기 |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | F1 ES 세포 배양을 위한 억제제 |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | F1 ES 세포 배양을 위한 |
| 억제제 LIF | Chemicon | ESG1107 | F1 ES 세포 배양을 위한 억제제 |
참고문헌
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A.
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