CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

Summary

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus).

Abstract

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Introduction

Des éléments de régulation transcriptionnelle sont critiques pour réglage fin spatio-temporelle de l' expression des gènes au cours du développement ¹ et la modification de ces éléments peut entraîner une maladie due à l' expression génique aberrante ^2. De nombreuses régions associées à des maladies identifiées par le génome des études d'association sont larges dans les régions non codantes et présentent des caractéristiques d'amplificateurs de transcription ^3-4. L' identification des amplificateurs et les harmoniser avec les gènes qu'ils régulent est compliqué car ils sont souvent situés à plusieurs kilobases à l' écart des gènes qu'ils régulent et peuvent être activées d'une manière spécifique au tissu ^5-6. Prévisions Enhancer sont généralement basées sur des marques de modification des histones, des complexes de médiateur-cohesin et la liaison de la cellule transcription spécifique de type facteurs ^7-10. La validation des amplificateurs de prédits est le plus souvent réalisé par un dosage à base de vecteur dans lequel l'activateur active l' expression d'un gène rapporteur ^11-12. Ces données fournissent vinformations ressources précieuses sur le potentiel de régulation des séquences amplificatrices putatives, mais ne révèlent pas leur fonction dans leur contexte génomique endogène ou d'identifier les gènes qu'ils régulent. édition du génome est un outil puissant pour étudier la fonction des éléments de régulation transcriptionnelle dans leur contexte endogène par l'analyse de perte de fonction.

Les progrès récents dans l'édition du génome, à savoir le / cas9 système de montage du génome CRISPR, faciliter l'enquête de la fonction du génome. Le système / cas9 CRISPR est facile à utiliser et adaptable à de nombreux systèmes biologiques. La protéine cas9 est ciblé à un site spécifique par une ARN de guidage (ARNg) ¹³ dans le génome. Le complexe SpCas9 / gARN analyse du génome pour sa séquence génomique cible qui doit être 5 'à une séquence protospacer motif adjacent (PAM), NGG ^14-15. Appariement de bases de l'ARNg à sa cible, un 20 nucleotides (nt) la séquence complémentaire de l'ARNg, active une activité nuclease SpCas9 résultant en un doublpause e brin (DSB) de 3 pb en amont de la séquence PAM. La spécificité est obtenue par appariement complet de la base dans la région de la graine gARN, le 12.06 nt adjacent à l'APM; à l' inverse, mal assortit 5 'de la graine sont généralement tolérés ^16-17. L'ORD a introduit peut être réparé soit par l'extrémité non homologue de jonction (NHEJ) réparation de l'ADN ou d'homologie de réparation dirigée (HDR) mechanisms.NHEJ réparation de l'ADN crée souvent insertion / délétion (indels) de quelques pb au niveau du site cible qui peut perturber le cadre ouvert de lecture (ORF) d'un gène. Pour générer de plus grandes deletions dans le génome de deux ARNg, qui flanquent la région d'intérêt, peuvent être utilisés ^{18 à 19.} Cette approche est particulièrement utile pour l'étude des amplificateurs de transcription regroupés en régions de contrôle de locus ou super-amplificateurs qui sont plus grands que des amplificateurs conventionnels ^9,18,20-22.

Suppressions monoallélique sont un modèle précieux pour l' étude cis – régulation de la transcription. Le chang observée au niveau de la transcription après la suppression monoallélique d'un activateur est en corrélation avec le rôle de cet activateur dans la régulation des gènes sans les effets de confusion qui peuvent se produire lorsque la transcription des deux allèles est affecté potentiellement influencer remise en forme cellulaire. L'évaluation de l'expression réduite est difficile sans toutefois la capacité de distinguer la suppression de l'allèle de type sauvage. En outre, le génotypage délétions à chaque allèle sans la capacité de distinguer les deux allèles est difficile, surtout pour les grandes suppressions de> 10 kb à 1 Mb ²³ , dans lequel il est difficile d'amplifier toute la région de type sauvage par PCR. L'utilisation de cellules ES F1 générées par croisement avec ¹²⁹ Mus musculus Mus castaneus permet aux deux allèles d'être différenciés par PCR spécifique d'allèle ^18,24. Le génome hybride dans ces cellules facilite le dépistage de la suppression spécifique de l'allèle et l'analyse d'expression. En moyenne, il y a un SNP tous les 125 pb entre ces deux génomes, Offrant une flexibilité dans la conception de l'amorce d'expression et de génotypage analyse. La présence d'un SNP peut influer sur la température d' amorce de fusion _(Tm) et la spécificité de cible en temps réel par PCR quantitative (qPCR) d' amplification permettant une discrimination des deux allèles ^25. En outre , un mésappariement à l'intérieur de l' extrémité 3 'de l'amorce influence grandement la capacité de l' ADN polymérase pour s'étendre à partir de l'amorce empêchant l' amplification de l'allèle cible indésirable ^26. Décrite dans le protocole suivant est l'utilisation de cellules ES F1 pour allèle spécifique enhancer suppressions de plus de 1 kb et analyse de l' expression suivante en utilisant le / cas9 système de montage du génome CRISPR (figure 1).

Figure 1. suppression Enhancer utilisant CRISPR / cas9 pour étudier cis -regulation de l' expression génique. (A) Les cellules ES F1 générées par un croisement entre Mus musculus ¹²⁹ et Mus castaneus sont utilisés pour permettre la suppression allèle spécifique. (B) Deux ARN de guidage (ARNg) sont utilisés pour induire une grande deletion à médiation par cas9 de la région amplificatrice. (C) Les amorces sont utilisées pour identifier les grandes mono- et délétions bi-alléliques. Les amorces orange sont les amorces à l'intérieur, les amorces violet sont les amorces externes et les amorces vertes sont les amorces flanquant gARN. (D) Les changements dans l' expression des gènes sont surveillés à l' aide spécifique d'allèle qPCR. RFU désigne des unités de fluorescence relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

1. Concevoir et construire l'gARN Pour supprimer les régions activatrices transcriptionnelles utilisent deux ARNg, une 5 'et une 3' de la région d'intérêt. Utilisez la piste de UCSC de la souris du navigateur du génome généré par le laboratoire Zhang pour identifier des séquences uniques gARN (http://www.genome-engineering.org 15). Vérifiez ensuite ces ARNg et leur PAM adjacent pour les SNP et indels en utilisant des outils en ligne fournis par l'Institut Sanger (www.s…

Representative Results

Le protocole décrit ici utilise des cellules ES F1 pour étudier cis – régulation de l' expression génique dans les cellules amplificatrices supprimé monoalléliques générés en utilisant CRISPR / cas9 édition du génome (Figure 1). Le gARN et la conception de l'amorce spécifique d'allèle pour le génotypage et l'expression génique sont les facteurs clés de cette approche. Chaque ensemble d'amorces spécifiques de l'allèle doi…

Discussion

CRISPR / cas9 technologie d'édition du génome médiation fournit une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour la modification du génome. La méthode détaillée ici pour générer et analyser monoallélique suppression d'activateur pour la caractérisation fonctionnelle enhancer tire profit de SNP dans les cellules de souris F1. Les avantages de ce type d'approche sont: 1) les suppressions d'activateurs monoalléliques ne produisent pas des effets de confusion qui se produisent quand un activateu…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S	high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824	A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP	Addgene	44719	Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII	NEB	R0520S
EcoRI	NEB	R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit	Life Technologies	MPK10096	Microporator transfection technology
prepGEM	ZyGEM	PT10500	genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit	Geneaid	PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free	Geneaid	PME25
SYBR select mix for CFX	Life Technologies	4472942	qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	170-8891	Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA	Life Technologies	25200072
PBS without Ca/Mg2+	Sigma	D8537
0.5M EDTA	Bioshop	EDT111.500
HBSS	Life Technologies	14175095
1M HEPES	Life Technologies	13630080
BSA fraction V (7.5%)	Life Technologies	15260037
Max Efficiency DH5α competent cells	Invitrogen	18258012
FBS	ES cell qualified		FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO	Sigma	D2650
Glutamax	Invitrogen	35050
DMEM	Life Technologies	11960069
Pencillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360
Non-essential aminoacid	Invitrogen	11140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
96-well plate	Sarstedt	83.3924
Sealing tape	Sarstedt	95.1994
CoolCell LX	Biocision	BCS-405	alcohol-free cell freezing container
CHIR99021	Biovision	1748-5	Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901	Invivogen	inh-pd32	Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF	Chemicon	ESG1107	Inhibitor for F1 ES cell culture