High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
A arte da produção de proteínas recombinantes com modificações pós-tradução complexas representa um grande desafio para estudos da estrutura e função. O estabelecimento rápido e elevada recuperação de linhas celulares de mamífero transf ectadas transitoriamente aborda esta barreira e é um meio eficaz para expressar as proteínas que são naturalmente canalizados através da via secretora do ER e Golgi-mediada. Aqui é um protocolo para a expressão da proteína usando a HEK293F humano e linhas de células HEK293S transfectadas com um vector de expressão de mamífero concebido para rendimentos elevados de proteína. A aplicabilidade desse sistema é demonstrada por meio de três glicoproteínas representativos que expressavam com rendimentos entre 95-120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultura. Estas proteínas são a FcγRIIIa humana e a sialiltransferase de rato α2-6, ST6GalI, ambos expressos com uma fusão com GFP N-terminal, bem como a imunoglobulina humana G1 Fc não modificada. Este robusto sistema utizará um meio isento de soro que é adaptável para a expressão de proteínas e hidratos de carbono para estudos estruturais, utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear isotopicamente enriquecidos. Além disso, a composição do N-glicano pode ser ajustado por adição de uma pequena molécula para evitar certas modificações de glicano de uma maneira que não reduz o rendimento.
Introduction
A produção de rendimentos elevados de proteínas humanas adequadamente dobrados e modificada pós-translacionalmente por análise detalhada da estrutura e função continua a ser um desafio significativo. Um grande número de sistemas de expressão disponíveis que produzem proteínas recombinantes com função e comportamento semelhante à nativa. Sistemas de expressão bacterianos, predominantemente estirpes de Escherichia coli, representam as ferramentas mais acessíveis e frequentemente utilizadas na área da pesquisa, devido à simplicidade destes sistemas de expressão, embora sistemas de mamíferos levedura, plantas, insectos e são também descritos 1-4. No entanto, a maioria destes sistemas são incapazes de modificação pós-tradução adequada das proteínas alvo. Um interesse fundamental dos laboratórios Barb e Moremen está produzindo proteínas eucarióticas com glicosilação apropriada. Muitas proteínas humanas exigem glicosilação adequada para o bom funcionamento (ver 5).
O eucarióticamaquinaria de glicosilação é extensa e capaz de fazer uma grande variedade de modificações, incluindo tanto a asparagina (N) – e serina / treonina (O) -linked glicanos complexos 6. Estima-se que> 50% das proteínas humanas são N-glicosilados 7. Glicanos são componentes essenciais de muitas proteínas incluindo anticorpos monoclonais terapêuticos, eritropoietina e fatores de coagulação do sangue, como factor IX, para citar alguns. Apesar de existirem vários métodos para preparar adequadamente proteínas N-glicosiladas e variam de puramente sintético 8-10, para 11-14 quimioenzimáticas ou recuperação de sistemas recombinantes engenharia 15-20, não surpreendentemente, sistemas de expressão humanos têm, até agora provou ser o mais robusto métodos para gerar proteínas humanas.
Muitos glicoproteínas terapêuticas humanos são produzidos em sistemas recombinantes que utilizam células de mamífero. Sistemas de nota são o de ovário de hamster chinês (CHO), mieloma de ratinho (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), rim embrionário humano (HEK-293) e linhas de células da retina humanas que são empregues na adesão ou suspensão de cultura para a produção de proteína 4,21,22. No entanto, os sistemas de expressão de proteína de mamífero têm exigido a geração de linhas celulares estáveis, meios de cultura caros e procedimentos de transfecção de substrato assistida 23.
Transfecção de células de mamífero é conseguido com o auxílio de numerosos agentes, incluindo fosfatos de cálcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) ou lipossomas catiónicos carregados positivamente 26-29. PEI é um policatiónico, carregada, linear ou ramificada de polímero (25 kDa) 26 que forma um complexo estável com o ADN e é sujeita a endocitose. Após acidificação do endossoma, PEI é pensado para inchar, levando à ruptura dos endossomas e libertação do ADN para o citoplasma 26,30.
Até recentemente, a transfecção transiente em suspensia cultura foi realizada por formação de complexos de ADN / PEI antes, seguido pela adição à cultura de células 29. No entanto, Würm e colaboradores relataram um protocolo optimizado altamente eficiente para a produção de proteína recombinante em células HEK293 que formaram um complexo de ADN / PEI in situ 31,32. Isto evitou a preparação, a esterilização do complexo, e a troca de tampão para um meio de cultura. Otimização, incluindo plasmídeos de aumento de expressão levaram a aumentos significativos de produtividade 33. Aqui é um método que se baseia esses avanços e é amplamente aplicável. Condições de expressão, também pode ser alterado para afectar a composição de N-glicanos.
A linha celular HEK293S, com uma deleção do gene que interrompe o processamento de N-glicano numa fase intermédia, leva-se à expressão de proteínas com uniformes N-glicanos que consistem de 2 resíduos de N-acetilglucosamina e mais cinco resíduos de manose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulasfalta a transferase de N-acetilglucosaminil I (GnTI) gene que é necessário para o processamento de N-glicanos a jusante 36,37. A utilização de inibidores de glicosiltransferase incluindo kifunensine, análogos de ácido siálico e fucose e o análogo de 2-desoxi-2-fluoro-fucose e possui efeitos de processamento de N-glicanos 38-41 limites semelhantes.
O protocolo aqui relatada utiliza o vector pGEn2 como mostrado na Figura 1 42,43, PEI assistida transfecção transiente em células de mamífero (linhas HEK293F HEK293S ou células), e a recuperação de rendimentos elevados de proteína apropriadamente glicosilada. Este sistema é robusto e pode acomodar vários factores, incluindo a marcação isotópica e engenharia de glicano para a produção de grandes títulos de proteínas recombinantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ilustra a expressão de proteína através da transfecção transitória de células HEK293F ou S. As condições de transfecção ideais estabelecidos nos laboratórios Barb e Moremen empregam uma combinação crítica de concentrações densidade celular e reagentes para atingir alta eficiência de transfecção. Considerações críticas na aplicação da presente protocolo incluem: manutenção de uma cultura estável antes da transfecção (com a cultura consistente vezes duplicação); transfecção…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelas subvenções K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dos Institutos Nacionais de Saúde, e por fundos do Roy J. Carver Departamento de Bioquímica, Biofísica e Biologia Molecular da Universidade de Iowa . O conteúdo desta obra é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
References
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. 생화학. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. 생화학. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. 생화학. 54 (2), 313-322 (2015).
