High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
El arte de la producción de proteínas recombinantes con complejas modificaciones post-traduccionales representa un desafío importante para los estudios de estructura y función. El rápido establecimiento y alta recuperación de las líneas de células de mamíferos transfectadas transitoriamente-aborda esta barrera y es un medio eficaz para la expresión de proteínas que se canalizan a través de la forma natural ER y Golgi vía secretora mediada. Aquí es un protocolo para la expresión de proteínas utilizando el HEK293F humana y líneas de células HEK293s transfectadas con un vector de expresión de mamífero diseñado para altos rendimientos de proteínas. La aplicabilidad de este sistema se demuestra mediante tres glicoproteínas representativos que expresaban con rendimientos entre 95 a 120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultivo. Estas proteínas son la FcRIIIa humana y la sialiltransferasa α2-6 rata, ST6GalI, ambos expresados con una fusión GFP N-terminal, así como la inmunoglobulina humana no modificada G1 Fc. Este robusto sistema utilizes un medio libre de suero que es adaptable para la expresión de proteínas e hidratos de carbono para estudios estructurales utilizando espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear isotópicamente enriquecidos. Además, la composición de la N-glicano se puede ajustar mediante la adición de una molécula pequeña para evitar que ciertas modificaciones de glicano de una manera que no reduce el rendimiento.
Introduction
La producción de altos rendimientos de proteínas humanas debidamente plegadas y después de la traducción modificados para el análisis detallado de la estructura y la función sigue siendo un reto importante. Un gran número de sistemas de expresión están disponibles que producen las proteínas recombinantes con la función y el comportamiento similar a la nativa. Sistemas de expresión bacterianos, predominantemente cepas de Escherichia coli, representan las herramientas más accesibles y comúnmente utilizados en el campo de la investigación, debido a la simplicidad de estos sistemas de expresión, aunque la levadura, plantas, insectos y sistemas de mamíferos son también describen a 1-4. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas son incapaces de modificación post-traduccional apropiado de las proteínas diana. Un interés fundamental de los laboratorios Barb y Moremen está produciendo proteínas eucariotas con glicosilación apropiada. Muchas proteínas humanas requieren glicosilación apropiada para la función apropiada (ver 5).
El eucariotamaquinaria de glicosilación es amplia y capaz de realizar una amplia gama de modificaciones, que incluye tanto la asparagina (N) – y serina / treonina (O) -vinculada glicanos complejos 6. Se estima que> 50% de las proteínas humanas son N-glicosilada 7. Los glicanos son componentes esenciales de muchas proteínas, incluyendo anticuerpos monoclonales terapéuticos, eritropoyetina y factores de coagulación de la sangre como el factor IX, para nombrar unos pocos. Aunque existen varios métodos para preparar proteínas adecuadamente N-glicosilada y van desde puramente sintético 8-10, a quimioenzimática 11-14 o la recuperación de los sistemas recombinantes ingeniería 15-20, como es lógico, los sistemas de expresión humanos hasta ahora han demostrado ser el más robusto métodos para generar proteínas humanas.
Muchos glicoproteínas humanas terapéuticas se producen en sistemas recombinantes utilizando células de mamíferos. Sistemas de la nota son el ovario de hámster chino (CHO), mieloma de ratón (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), del riñón embrionarias humanas (HEK-293) y líneas de células de la retina humanos que se emplean en la adhesión o suspensión de cultivo para la producción de proteínas 4,21,22. Sin embargo, los sistemas de expresión proteína de mamífero han requerido la generación de líneas celulares estables, medios de crecimiento y el sustrato asistida caros procedimientos de transfección 23.
La transfección de células de mamífero se consigue con la ayuda de numerosos agentes, incluyendo fosfatos de calcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) o liposomas catiónicos cargados positivamente 26-29. PEI es un policatiónico, cargada, lineal o polímero ramificado (25 kDa) 26 que forma un complejo estable con el ADN y se endocitosis. Tras la acidificación del endosoma, PEI se piensa a hincharse, lo que lleva a la ruptura de endosomas y la liberación del ADN en el citoplasma 26,30.
Hasta hace poco, la transfección transitoria en Suspensiònen la cultura fue llevado por la formación de complejos de ADN / PEI antes seguido de la adición al cultivo celular 29. Sin embargo, Würm y compañeros de trabajo informó de un protocolo altamente eficiente optimizado para la producción de proteínas recombinantes en células HEK293 que formaban un complejo ADN / PEI in situ 31,32. Esto evitó la preparación, la esterilización del complejo, y el intercambio de tampón en un medio de cultivo. Además optimización incluyendo plásmidos de expresión para mejorar llevado a aumentos de rendimiento significativa 33. Aquí un método que se basa en estos avances y es ampliamente aplicable. Condiciones de expresión también pueden alterarse para afectar a la composición de N-glicano.
La línea de células HEK293s, con una deleción del gen que detiene el procesamiento de N-glicano en una etapa intermedia, conduce a la expresión de proteínas con uniformes N-glicanos que consta de 2 residuos de N-acetilglucosamina más cinco residuos de manosa (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulascarecer de la N-acetilglucosaminil transferasa I (GnTI) de genes que se requiere para N-glicano de procesamiento aguas abajo 36,37. El uso de inhibidores de glicosiltransferasa incluyendo kifunensine, análogos del ácido siálico y el análogo de fucosa y 2-desoxi-2-fluoro-fucosa tiene efectos y los límites de procesamiento de N-glicano 38 a 41 similares.
El protocolo informó aquí utiliza el vector pGEN2 como se muestra en la Figura 1 42,43, PEI transfección asistida transitoria en líneas de células de mamíferos (HEK293F o células HEK293s), y la recuperación de altos rendimientos de proteína apropiadamente glicosilada. Este sistema es robusto y puede acomodar varios factores, incluyendo el etiquetado de isótopos y la ingeniería glicano para la producción de grandes títulos de proteínas recombinantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ilustra la expresión de proteínas a través de la transfección transitoria de células HEK293F o S. Las condiciones de transfección óptimas establecidas en los laboratorios de Barb y Moremen emplean una combinación crítica de las concentraciones de densidad celular y reactivos para lograr una alta eficiencia de transfección. Consideraciones críticas en la aplicación de este protocolo son: mantener una cultura estable antes de la transfección (con cultura coherente veces doblando); la transfecci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por las subvenciones K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) y P01GM107012 (KWM) de los Institutos Nacionales de Salud, y con fondos del Departamento de Roy J. Carver de Bioquímica, Biofísica y Biología Molecular en la Universidad Estatal de Iowa . El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
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