High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
L'art de la production de protéines recombinantes avec des modifications post-traductionnelles complexes représente un défi majeur pour les études de structure et la fonction. La mise en place rapide et de récupération élevés de lignées cellulaires de mammifères transitoirement transfectées aborde cette barrière et est un moyen efficace d'exprimer des protéines qui sont naturellement acheminée par le ER et Golgi voie de sécrétion médiée. Voici un protocole pour l'expression de protéine en utilisant la HEK293F humain et des lignées de cellules transfectées HEK293S avec un vecteur d'expression de mammifère destiné à des rendements élevés de protéines. L'applicabilité de ce système est démontrée en utilisant trois glycoprotéines représentatives qui ont exprimé avec des rendements entre 95-120 mg de protéine purifiée récupérée par litre de culture. Ces protéines sont le FcyRIIIa humain et la sialyltransférase α2-6 de rat, ST6GalI, tous deux exprimés avec une fusion GFP N-terminale, ainsi que l'immunoglobuline humaine non modifiée G1 Fc. Cette robustes uti systèmeLizes un milieu exempt de sérum qui peut être adapté pour l'expression de protéines et d'hydrates de carbone pour des études structurales par spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire isotopiquement enrichis. En outre, la composition du N-glycane peut être réglée par addition d'une petite molécule pour empêcher certaines modifications glycanniques d'une manière qui ne réduit pas le rendement.
Introduction
Produire des rendements élevés de protéines humaines pliées de manière appropriée et modifications post-traductionnelles pour l'analyse détaillée de la structure et de la fonction demeure un défi important. Un grand nombre de systèmes d'expression sont disponibles qui produisent des protéines recombinantes avec fonction native-like et le comportement. Systèmes d'expression bactériens, principalement des souches d'Escherichia coli, représentent les outils les plus accessibles et couramment utilisés dans le domaine de la recherche, en raison de la simplicité de ces systèmes d'expression, bien que la levure, des plantes, les insectes et les mammifères sont également décrits 1-4. Cependant, la plupart de ces systèmes sont incapables de modification post-traductionnelle appropriée des protéines cibles. Un intérêt fondamental des laboratoires Barb et Moremen est la production de protéines eucaryotes avec une glycosylation appropriée. Beaucoup de protéines humaines exigent glycosylation appropriée pour le bon fonctionnement (voir 5).
Le eucaryotemachines de glycosylation est vaste et capable de faire un large éventail de modifications, incluant à la fois l'asparagine (N) – et de la sérine / thréonine (O) lié en glycanes complexes 6. On estime que> 50% des protéines humaines sont N-glycosylées 7. Glycanes sont des composantes essentielles de nombreuses protéines, y compris des anticorps thérapeutiques monoclonaux, l'érythropoïétine, et les facteurs de coagulation du sang comme le facteur IX, pour ne nommer que quelques-uns. Bien que plusieurs méthodes existent pour préparer des protéines convenablement N-glycosylée et vont de purement synthétique 8-10, 11-14 à chimioenzymatiques ou la récupération de systèmes recombinants d'ingénierie 15-20, sans surprise, des systèmes d'expression humains ont jusqu'ici avéré être le plus robuste des procédés pour générer des protéines humaines.
De nombreuses glycoprotéines humaines thérapeutiques sont produits dans des systèmes recombinants en utilisant des cellules de mammifères. Systèmes de la note sont l'ovaire de hamster chinois (CHO), myélome de souris (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), de rein embryonnaire humain (HEK-293) et des lignées de cellules rétiniennes humaines qui sont utilisés dans l'adhésion ou de la suspension de culture pour la production de protéine 4,21,22. Cependant, les systèmes d'expression de protéines de mammifère ont nécessité la production de lignées cellulaires stables, des milieux de croissance et le substrat coûteuses procédures de transfection assistée 23.
La transfection de cellules de mammifère est obtenue à l'aide de nombreux agents, y compris les phosphates de calcium, les polymères cationiques 24,25 (DEAE-dextrane, le polybrène, la polylysine, polyéthylimine (PEI)) ou des liposomes cationiques chargés positivement 26-29. PEI est un polycationique, chargé, linéaire ou ramifié en polymère (25 kDa) 26 qui forme un complexe stable avec l'ADN et est endocytose. Lors de l'acidification de l'endosome, PEI est pensé pour gonfler, ce qui conduit à la rupture des endosomes et la libération de l'ADN dans le cytoplasme de 26,30.
Jusqu'à récemment, la transfection transitoire dans suspensila culture a été réalisée par la formation du complexe ADN / PEI avant suivie de l'addition à la culture de cellules 29. Cependant, Würm et ses collaborateurs ont rapporté un protocole est performant optimisé pour une production de protéines recombinantes dans des cellules HEK293 qui ont formé un complexe ADN / PEI in situ 31,32. Ceci évite préparation, la stérilisation du complexe, et l'échange de tampon dans un milieu de culture. Poursuite de l'optimisation en incluant des plasmides d'expression amélioration conduit à une augmentation significative de rendement 33. Est ici une méthode qui se fonde sur ces avancées et est largement applicable. Conditions d'expression peuvent aussi être modifiées pour influer sur la composition de N-glycanes.
La lignée cellulaire HEK293S, avec une deletion de gène qui interrompt le traitement de N-glycane à un stade intermédiaire, conduit à l'expression de protéines avec des uniformes N-glycanes comprenant 2 résidus N-acétylglucosamine et cinq résidus de mannose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Ces cellulespas la N-acétylglucosaminyl transférase I (GntI) gène qui est nécessaire pour la N-glycane en aval traitement 36,37. L'utilisation d'inhibiteurs de glycosyltransférase comprenant kifunensine, des analogues d'acide sialique et l'analogue de fucose et de 2-désoxy-2-fluoro-fucose a des effets de traitement et les limites de N-glycane 38-41 similaires.
Le protocole indiqué ici utilise le vecteur pGEN2 comme représenté sur la figure 1 42,43, PEI transfection transitoire dans des cellules assistée lignes de mammifères ou des cellules HEK293F (HEK293S), et la récupération des rendements élevés de protéine glycosylée de façon appropriée. Ce système est robuste et peut accueillir divers facteurs, notamment marquage isotopique et de l'ingénierie glycane pour la production de grandes titres de protéines recombinantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole illustre l'expression de la protéine par l'intermédiaire de la transfection transitoire de cellules HEK293F ou S. Les conditions de transfection optimales établies dans les laboratoires et Barb Moremen emploient une combinaison critique de concentrations de densité de cellules et de réactifs pour réaliser la transfection à haut rendement. Considérations critiques lors de la mise en œuvre de ce protocole comprennent: le maintien d'une culture stable avant la transfection (avec la culture…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par les subventions K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) et P01GM107012 (KWM) des Instituts nationaux de la santé, et par des fonds provenant du Roy J. Carver Département de biochimie, biophysique et biologie moléculaire à l'Université de l'Iowa . Le contenu de ce travail est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
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