ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
האמנות של ייצור חלבונים רקומביננטיים עם לאחר translational שינויים מורכבים מהווה אתגר גדול ללימודים של מבנה ותפקוד. ההקמה המהירה וגבוהה התאוששות משורות תאי יונקים זמני-transfected מטפל המחסום הזה והוא אמצעי יעיל לביטוי חלבונים שמופנים דרך חדר המיון ומסלול הפרשה בתיווך Golgi באופן טבעי. הנה פרוטוקול אחד לביטוי חלבון באמצעות HEK293F האדם ושורות תאי HEK293S transfected עם וקטור ביטוי יונקים מיועדים לתשואות גבוהות של חלבון. תחולתה של מערכת זו באה לידי ביטוי בשלושת גליקופרוטאינים הנציג שבאו לידי ביטוי בתשואות בין 95-120 מ"ג של חלבון מטוהר התאושש לליטר התרבות. חלבונים אלה הם FcγRIIIa האנושי וsialyltransferase העכברוש α2-6, ST6GalI, שני הביע עם פיוז'ן GFP N-מסוף, כמו גם אימונוגלובולינים אדם ללא שינוי G1 Fc. UTI מערכת חזק זהlizes בינוני סרום ללא שניתן להתאמה לביטוי של חלבונים ופחמימות ללימודים מבניים באמצעות ספקטרומטר המסה וספקטרוסקופיה בתהודה המגנטית הגרעינית מועשרים isotopically. יתר על כן, הרכב של N-הסוכרים יכול להיות מכוון על ידי הוספת מולקולה קטנה כדי למנוע שינויי סוכרים מסוימים באופן שאינו מפחית תשואה.
Introduction
הפקת תשואות גבוהות של חלבונים אנושיים כראוי מקופלים ופוסט-translationally שונה לניתוח מפורט של מבנה ותפקוד עדיין מהווה אתגר משמעותי. מספר גדול של מערכות ביטוי זמין המייצרים חלבונים רקומביננטי עם פונקציה והתנהגות כמו-ילידים. מערכות חיידקי ביטוי, בעיקר זני Escherichia coli, מייצגים את הכלים הנגישים ביותר ונפוצים בזירת המחקר, בשל הפשטות של מערכות ביטוי אלה, אם כי שמרים, מפעל, חרקים ומערכות יונקים הן גם תיארו 1-4. עם זאת, הרוב המכריע של מערכות אלה אינם מסוגלים שינוי לאחר translational המתאים של חלבוני היעד. ריבית בסיסית של המעבדות בארב וMoremen מייצרת חלבוני אוקריוטים עם glycosylation המתאימה. חלבונים אנושיים רבים דורשים glycosylation המתאימה לתפקוד תקין (ראה 5).
אוקריוטיםמכונות glycosylation היא נרחבות ומסוגלות לבצע מגוון רחב של שינויים, כולל שני asparagine (N) – וסרין / תראונין (O) -linked glycans המורכב 6. ההערכה היא כי> 50% מחלבונים אנושיים הם N glycosylated-7. Glycans הם מרכיבים חיוניים של חלבונים רבים, כולל נוגדנים חד שבטיים טיפוליים, אריתרופויאטין, וגורמי קרישת דם כמו התשיעי גורם, עד כמה שם. למרות מספר שיטות קיימות להכנת חלבונים כראוי N-מסוכרים ונעות בין טהור סינטטי 8-10, לchemoenzymatic 11-14 או התאוששות ממערכות מהונדסות רקומביננטי 15-20, שלא במפתיע, מערכות ביטוי אנושיות עד כה הוכיחו להיות חזק ביותר שיטות ליצירת חלבונים אנושיים.
גליקופרוטאינים אדם טיפוליים רבים מיוצרים במערכות רקומביננטי באמצעות תאי יונקים. מערכות של לב הם השחלות סיניות (CHO), מיאלומה עכבר (NS0), בייבי אוגר Kidney (BHK), כליה העוברית אנושי (HEK-293) ושורות תאים ברשתית אנושיות שמועסקות בתרבות הידבקות או השעיה לייצור חלבון 4,21,22. עם זאת, מערכות ביטוי חלבון יונקים נדרשו הדור של קווים יציבים תא, תקשורת צמיחה יקרה ונהלי transfection מצע סייע 23.
transfection תאים היונקים מושגת בעזרת סוכנים רבים כוללים פוספטים סידן 24,25, פולימרים קטיוני (DEAE-dextran, polybrene, polylysine, polyethylimine (PEI)) או ליפוזומים קטיוני טעונים חיובי 26-29. PEI הוא polycationic, טעון, ליניארי או פולימר מסועף (25 KDA) 26 שיוצר מורכב יציב עם DNA והוא endocytosed. על החמצה של אנדוזום, הוא חשב PEI להתנפח, שהוביל לקרע של endosomes ושחרורו של ה- DNA לתוך 26,30 ציטופלסמה.
עד לאחרונה, transfection חולף בsuspensiעל התרבות בוצע על ידי היווצרות מורכבת לפני DNA / PEI אחרי בנוסף לתרבית תאי 29. עם זאת, וורם ועמיתים לעבודה דיווחו פרוטוקול יעיל ביותר מותאם לייצור חלבון רקומביננטי בHEK293 תאים שיצרו מורכב DNA / PEI באתר 31,32. זה נמנע הכנה, עיקור של המתחם, וחילופי חיץ למדיום תרבות. אופטימיזציה נוספת על ידי כולל פלסמידים שיפור ביטוי הובילו לעליית תשואה משמעותית 33. מסמך זה הוא שיטה שמתבססת על התפתחויות הללו והיא באופן כללי החלים. תנאי ביטוי גם עשויים להשתנות להשפיע על הרכב N-סוכרים.
קו HEK293S התא, עם מחיקת גן שעוצרת עיבוד N-סוכרים בשלב ביניים, מוביל לביטוי של חלבונים עם המדים N-glycans בהיקף של 2 שאריות N-acetylglucosamine ועוד חמש שאריות מנוז (איש 5 GlcNAc 2) 34, 35. תאים אלהחסר transferase N-acetylglucosaminyl אני (GntI) גן אשר נדרש לעיבוד N-סוכרים במורד הזרם 36,37. השימוש במעכבי glycosyltransferase כוללים kifunensine, תחליפי חומצת sialic והאנלוגי fucose ו2-deoxy-2-fluoro-fucose יש השפעות וגבולות עיבוד N-38-41 סוכרים דומים.
הפרוטוקול דיווח כאן משתמש בוקטור pGEn2 כפי שמוצג באיור 1 42,43, PEI transfection סייע החולף לקווי יונקים תאים (HEK293F או תאי HEK293S), וההתאוששות של תשואות גבוהות של חלבון glycosylated כראוי. מערכת זו היא חזקה ויכולה להכיל גורמים שונים, כוללים תיוג איזוטופ והנדסת סוכרים לייצור titers הגדול של חלבונים רקומביננטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה ממחיש ביטוי חלבון באמצעות transfection החולף של תאי HEK293F או S. התנאים אופטימליים transfection הוקמו במעבדות בארב וMoremen להעסיק שילוב קריטי של ריכוזי צפיפות תאים ומגיבים להשגת transfection יעילות הגבוהה. שיקולים קריטיים בעת יישום פרוטוקול זה כוללים: שמירה על תרבות יציבה לפני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענקים K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) וP01GM107012 (KWM) מהמכון הלאומי לבריאות, ועל ידי קרנות מרוי ג 'המחלקה לביוכימיה קארבר, ביופיסיקה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת איווה סטייט . התוכן של עבודה זו הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
References
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
- Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
- Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
- Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
- Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
- Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
- Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
- Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
- Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
- Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
- Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
- Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
- Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
- Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
- Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
- Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
- Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
- Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
- Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
- Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
- Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
- Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
- Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
- Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
- Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. 생화학. 51 (22), 4618-4626 (2012).
- Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
- Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. 생화학. 48 (41), 9705-9707 (2009).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
- Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
- Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
- Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
- Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. 생화학. 54 (2), 313-322 (2015).
