تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
من أجل دراسة المسارات الجزيئية من مرض باركنسون (PD) ووضع استراتيجيات علاجية جديدة والمحققين العلمي تعتمد على النماذج الحيوانية. وقد أدى تحديد الجينات المرتبطة PD إلى تطوير نماذج PD الوراثية. الأكثر المعدلة وراثيا نماذج الماوس α-SYN تتطور تدريجيا α-SYN علم الأمراض ولكن تفشل في عرض واضحة فقدان الخلية الدوبامين والعجز السلوكية التي تعتمد على الدوبامين. تم التغلب على هذه العقبة الاستهداف المباشر من المادة السوداء مع النواقل الفيروسية overexpressing الجينات المرتبطة PD. توصيل الجينات المحلي باستخدام ناقلات فيروسية يوفر وسيلة جذابة للتعبير عن الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استهداف مناطق محددة في الدماغ (مثل المادة السوداء)، والتعبير يمكن أن يتسبب في الإعداد الكبار ومستويات التعبير العالية يمكن أن يتحقق. وعلاوة على ذلك، نظم ناقلات مختلفة على أساس مختلف الفيروسات يمكن استخدامها. يحدد البروتوكول كل خطوات حاسمة لأداء ناقل فيروسيالحقن في المادة السوداء من الفئران لتطوير ألفا synuclein نموذج حيواني ناقلات القائم على الفيروسي لمرض الشلل الرعاش.
Introduction
لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لPD ووضع استراتيجيات علاجية جديدة، هناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية تشبه عن كثب أمراض الأعصاب، علم وظائف الأعضاء والحركية أعراض PD البشري. ارتفاع القيمة التنبؤية، وأفضل ونحن يمكن أن تترجم علاجات جديدة من النماذج الحيوانية للمرضى.
أدى اكتشاف ألفا synuclein (α-SYN) كأول جين بارك في عام 1997 لتطوير النماذج الأولى PD الوراثية. وقد تم إنشاء العديد من الفئران المعدلة وراثيا overexpressing البشري من النوع البري (WT) أو متحولة (A30P، A53T) α-SYN على مدى العقد الماضي. وقد أثبتت مستويات overexpression α-SYN أن تكون حاسمة في تطور علم الأمراض. أيضا سلالة الماوس، وجود أو عدم وجود الذاتية α-SYN وما إذا كان يتم التعبير عن كامل طول أو شكل اقتطاع، يلعب دور (استعراض مفصل من قبل ماجن وChesselet 1). overexpression من كلا WT والعديد من المسوخ السريرية البشرية و# 945؛ -SYN في الفئران المعدلة وراثيا يؤدي الى تراكم المرضي للα-SYN واختلال الوظائف العصبية 2-6. ولكن، حتى الآن فشلت معظم المعدلة وراثيا نماذج الماوس α-SYN لعرضه واضحة فقدان الخلية الدوبامين والعجز السلوكية التي تعتمد على الدوبامين.
تم التغلب على هذه العقبة الاستهداف المباشر من المادة السوداء (SN) مع النواقل الفيروسية overexpressing ألفا-SYN. وتستمد ناقلات فيروسية من الفيروسات التي يمكن بسهولة تصيب الخلايا، وإدخال مادة وراثية في الجينات التي تستضيفهم وإجبار الخلية المضيفة لتكرار الجينوم الفيروسي من أجل إنتاج جزيئات الفيروس الجديدة. يمكن هندستها الفيروسات لناقلات غير تكرار الفيروسية التي تحتفظ قدرتهم على دخول الخلايا وإدخال جينات. عن طريق حذف أجزاء من الجينوم الفيروسي والاستعاضة عنها الجينات في المصالح، وتطبيق ناقلات يؤدي الى عدوى جولة واحدة دون تكرارها في الخلية المضيفة، المعين بصفة عامة "التنبيغ". ناقلات فيروسية جعلى أن تستخدم في كل overexpression وإسكات الجينات. التحوير أعرب يمكن أن يكون البروتين مراسل (على سبيل المثال الأخضر بروتين فلوري أو يراعة وسيفيراز) 7، وهو البروتين العلاجي للتطبيقات العلاج الجيني 8-10، ونحن سوف نركز عليها في هذه الورقة، وهو بروتين المتعلقة بالأمراض تستخدم لنمذجة المرض 11 -14.
يوفر الفيروسي بوساطة ناقلات توصيل الجينات وسيلة بديلة للتعبير عن الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي مع العديد من المزايا. عن طريق تسليم التحوير المحلي، مناطق محددة في الدماغ يمكن أن تكون مستهدفة. وعلاوة على ذلك، التعبير التحوير يمكن أن يتسبب خلال مرحلة البلوغ تقليل مخاطر الآليات التعويضية خلال التنمية. أيضا، نماذج يمكن إنشاؤها في أنواع وسلالات مختلفة. وأخيرا، الجينات المحورة مختلفة يمكن بسهولة مجتمعة. باستخدام ناقلات فيروسية، ومستويات التعبير عالية التحوير لا يمكن أن يتحقق، والتي قد تكون حاسمة منذ بداية ظهور أعراض المرض وشدة في كثير من الأحيان تعتمد على مستوى overexpression.
وقد تم تطوير عدة أنظمة ناقل القائمة على الفيروسات المختلفة. اختيار نظام ناقل يعتمد على حجم الجين من الفائدة، ومدة المطلوبة في التعبير الجيني، والخلايا المستهدفة، وقضايا السلامة الأحيائية. لنقل الجينات مستقرة في الدماغ، lentiviral (LV) والمؤتلف الفيروسية الغدة المرتبطة تعتبر (rAAV) ناقلات الآن أنظمة ناقلات الاختيار لأنها تؤدي إلى التعبير الجيني فعالة وطويلة الأمد في الدماغ القوارض. لاستهداف معين من الخلايا العصبية الدوبامين (DN) من SN، ناقلات rAAV وoutcompeted تدريجيا ناقلات LV بسبب التتر من أعلى وكفاءة تنبيغ DN.
وقد وضعت أفضل α-SYN نماذج القوارض أساس المتاحة حاليا من نهج موحد باستخدام الأنماط المصلية AAV أحدث (rAAV 1، 5، 6، 7، 8) والأمثل يبني ناقلات، التتر، ونقاء 15،16. عيار ناقلات فضلا عن نقاء ناقلات يؤثر بشكل مباشرنتائج المظهرية للنموذج. التتر ناقلات المفرطة أو دفعات ناقلات النقاء كاف قد يؤدي إلى سمية غير محددة. لذلك، ناقلات المراقبة المناسبة لا غنى عنها. وقد أثبتت كبيرا للاستثمار الوقت في إنتاج ناقلات، الارتقاء، والإجراءات تنقية الفيروسية أيضا ضروري للحصول على دفعات ناقلات نوعية استنساخه وعالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. عيار ناقلات فضلا عن نقاء ناقلات يؤثر بشكل مباشر على نتائج المظهرية للنموذج. التتر ناقلات المفرطة أو دفعات ناقلات النقاء كاف قد يؤدي إلى سمية غير محددة. ولذلك، فإن استخدام دفعات ناقلات جودة عالية وناقلات الرقابة المناسبة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر يوريس فان Asselberghs وآن فان Santvoort للحصول على المساعدة الفنية الممتازة. وقد تم تمويل البحث من قبل IWT-VLAANDEREN (IWT الثانوي المهني / 80020)، وFWO VLAANDEREN (G.0768.10)، من خلال برنامج EC-FP6 "ديمي" (LSHB-CT-2005-512146)، ومشروع MEFOPA FP7 RTD (الصحة -2٬009-241٬791)، وبرنامج FP7 "INMiND" (الصحة-F2-2011-278850)، جامعة الكويت لوفين (قوات الاحتلال الإسرائيلي-KP / 07/001، OT / 08 / 052A، IMIR PF / 10/017)، و مؤسسة MJFox (التحقق من صحة هدف عام 2010). A. فان دير بيرين وجيم Casteels هي زملاء ما بعد الدكتوراه من صندوق الفلمنكية البحث العلمي. ك فان Laere هو زميل السريرية كبار من صندوق الفلمنكية البحث العلمي.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
