재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
파킨슨 병 (PD)의 분자 경로를 연구하고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해, 과학 연구자들은 동물 모델에 의존한다. PD 관련 유전자의 확인은 유전 PD 모델의 개발을 유도 하였다. 대부분의 유전자 변형 α-SYN 마우스 모델은 점진적 α-SYN 병리학을 개발하지만 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하지 못합니다. 이 장애물은 PD 관련 유전자를 과발현 바이러스 벡터와 흑색질의 직접 타겟팅에 의해 극복되었다. 바이러스 벡터를 사용하여 로컬 유전자 전달은 중추 신경계의 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공한다. 뇌의 특정 영역 (예 흑색질) 대상이 될 수있는 발현 성인 환경에서 발생 될 수 있으며, 높은 발현 수준이 달성 될 수있다. 또한, 다양한 바이러스 벡터에 따라 서로 다른 시스템을 사용할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터를 수행하기 위해 모든 중요한 단계를 설명쥐의 흑색질 주사 파킨슨 질환 바이러스 벡터 기반의 α- 시누 클레인의 동물 모델을 개발한다.
Introduction
PD의 기전을 연구하고, 새로운 치료 전략을 개발 밀접 인간 PD의 병리학 생리학 모터 증상 유사한 동물 모델에 대한 긴급한 필요성이있다. 높은 예측도는, 더 나은 우리는 환자에게 동물 모델에서 새로운 치료법을 변환 할 수 있습니다.
1997 년 제 PARK 유전자 등의 α- 시누 클레인의 발견 (α-SYN)가 제 유전자 PD 모델의 개발을 이끌었다. 인간 야생형 (WT) 또는 돌연변이 (A30p의, A53T)를 과발현 많은 형질 전환 마우스 α-SYN은 지난 10 년 동안 생성되었습니다. α-SYN 과발현의 수준은 병리학의 발전에 중요한 것으로 입증했습니다. 또한 마우스 균주 내생 α-SYN 및 전장 또는 절단 된 형태의 발현 여부 유무 (Magen 및 Chesselet (1)에 의한 심층 분석) 역할을한다. WT 인간의 여러 임상 돌연변이 모두의 과발현 및# 945; 형질 전환 마우스에서 -SYN은 α-SYN의 병리학 적 축적과 신경 기능 장애 2-6을 유도한다. 그러나 지금은 대부분의 형질 전환 α-SYN 마우스 모델은 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하는 데 실패 할 때까지.
이 장애물은 α-SYN를 과발현 바이러스 벡터와 흑색질 (SN)의 직접 타겟팅에 의해 극복되었다. 바이러스 벡터를 용이하게, 세포를 감염 그들의 숙주 게놈에 유전 물질을 도입하고 새로운 바이러스 입자를 제조하기 위하여 바이러스 게놈을 복제하는 숙주 세포를 강제 바이러스로부터 유도된다. 바이러스는 세포를 입력하고 유전자를 도입 할 수있는 능력을 보유 비 복제 바이러스 벡터를 설계 할 수있다. 바이러스 게놈의 일부를 삭제하고 관심있는 유전자에 의해이를 대체하여, 벡터의인가는 일반적으로 "전달"로 지정된 숙주 세포에서 복제하지 않고 단일 라운드 감염 될 것이다. 바이러스 성 벡터 다이 과발현 유전자 침묵 모두 사용될. 표현 형질 전환 유전자는 리포터 단백질 (예를 들어 녹색 형광 단백질 또는 반딧불 루시 페라 제) 7, 우리는이 논문에서에 초점을 맞출 것이다으로 치료 유전자 치료 응용 프로그램에 8-10에 대한 단백질 또는 일 수있다, 질병 관련 단백질은 질병 모델링 (11)에 사용 -14.
바이러스 성 벡터 매개 유전자 전달은 여러 가지 장점으로 CNS의 유전자를 표현하는 다른 방법을 제공합니다. 로컬 유전자 전달을 이용하여, 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있다. 또한, 유전자 발현이 발달 동안에 보상기구의 위험을 감소 성인기 유도 될 수있다. 또한, 모델은 다른 종과 변종을 만들 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 다른 트랜스 쉽게 결합 될 수있다. 바이러스 벡터를 사용하여, 높은 유전자 발현 수준은 질병의 발병 및 심각도 자주 overexp의 레벨에 의존 때문에 중요 할 수도있는, 달성 될 수있다ression.
다른 바이러스 벡터에 기초하여 여러 가지 시스템들이 개발되어왔다. 벡터 시스템의 선택은 관심의 유전자의 유전자 발현은 표적 세포 및 생물 안전성 문제에 필요한 시간의 크기에 따라 달라진다. 그들은 쥐의 뇌에서 효율적이고 장기적인 유전자 발현으로 이어질 때문에 뇌, 렌티 바이러스 (LV)에서 안정적인 유전자 전달 및 재조합 아데노 관련 바이러스의 경우 (rAAV) 벡터는 이제 선택의 벡터 시스템으로 간주됩니다. SN의 도파민 신경 세포 (DN)의 특정 타겟팅를 들어, rAAV 벡터는 점차 때문에 높은 역가 및 DN의 전달 효율 LV 벡터를 outcompeted있다.
현재 가장 α-SYN 기반 설치류 모델은 새로운 AAV 혈청 형을 이용한 결합 방식에서 개발되었다 (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) 및 벡터 작 제물, 역가 및 순도 15,16 최적화. 벡터 역가뿐만 아니라 벡터 순도 직접 영향모델의 표현형 결과. 과도한 벡터 역가 또는 불충분하게 정제 된 벡터 배치가 아닌 특정 독성이 발생할 수 있습니다. 따라서, 적절한 제어 벡터는 필수적이다. 바이러스 벡터 생산, 업 스케일링 및 정제 과정에서 상당한 시간 투자도 재현 고품질 벡터 배치를 얻기 위해 필수적인 입증했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 벡터 역가뿐만 아니라 벡터 순도는 직접 모델 표현형 결과에 영향을 미친다. 과도한 벡터 역가 또는 불충분하게 정제 된 벡터 배치가 아닌 특정 독성이 발생할 수 있습니다. 따라서, 높은 품질 벡터 배치 및 적절한 제어 벡터의 사용은 필수적이다. 또한, 고정대에 쥐의 머리의 정확한 위치와 좌표의 정확한 결정은 흑질 타겟팅 필수적이다. 주사 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 뛰어난 기술 지원을 요리스 반 Asselberghs 앤 반 Santvoort 감사합니다. 연구는 EC-FP6 프로그램 'DiMI'(LSHB-CT-2005-512146), FP7 RTD 프로젝트 MEFOPA (HEALTH에 의해, IWT-데런 (/ 80020 IWT SBO), FWO 데런 (G.0768.10)에 의해 투자되었다 -2009-241791), FP7 프로그램 'INMiND'(HEALTH-F2-2011-278850), KU 루벤 (IOF-KP / 07 / 001, m / 08 / 052A, IMIR PF / 10 / 017), 및 MJFox 재단 (대상 확인 2010). A. 반 데르 Perren와 C. Casteels는 과학 연구의 플랑드르 기금의 박사 후 동료입니다. K. 반 Laere는 과학 연구의 플랑드르 기금의 수석 임상 사람이다.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
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