Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
По сравнению с обычной электрической стимуляции, фотостимуляции обеспечивает большую временное и пространственное разрешение с минимальным вмешательством в физиологической системе образцов. Так как демонстрации использования лазеров для стимуляции нейронов в 1971 году 1, многие творческие пути были изобретены , чтобы экзогенно контролировать активность нейронов с помощью света. Оптический выпуск photocaged агонистов уже давно используется для изучения физиологической реакции нейронной сети для лигандов 2,3,4. Этот метод имеет ограниченную специфичность за счет диффузии проарретированных агонистов. Генетическая специфичность достигается за счет эктопически , выражающих светочувствительных Opsin каналов и насосов 5,6,7, и он был успешно применен для модуляции выбранных нейронных сетей в различных модельных организмах. Тем не менее, было бы трудно применить этот метод к оптически контролировать различные другие нейронные белки, так как прививка photoresponsiveness из Opsin белков с другими белками would требуют интенсивного инженерии, которые могут изменить естественные свойства белка в исследовании. Химически привязывать экзогенный светочувствительная лиганда с белком показал еще один способ контролировать функциональность канала белков 8,9,10. Лиганд представлен или выведены из сайта связывания белка через фотоизомеризации азобензола фрагмента. Привязывание химии ограничивает применение главным образом к внеклеточной стороне мембранных белков, за исключением внутриклеточную сторону и внутриклеточных белков.
Фоточувствительных УААН, после того, как включаются в белки, обеспечивают общую стратегию манипулирования белки со светом. В начале усилий, химически тРНК ацилируют с photocaged УААН были микроинъекции в ооциты Xenopus включать УААН в мембранных рецепторов и ионных каналов 11, которые продвинули понимание их структурно-функциональных отношений 12,13,14.Этот микроинъекции подход в основном ограничивается крупными ооцитов. Генетическое введение в UAA минует технически сложной ацилирования тРНК и микроинъекции с использованием ортогонального тРНК / синтетазы пару, которая включает в UAA через эндогенного трансляции белков в живых клетках 15,16,17,18. Uaa включение в нейрональных белков было продемонстрировано в первичных нейронов и нервных стволовых клеток 19,20. Совсем недавно, фоточувствительных Uaa генетически включены в нейрональных белка в головном мозге млекопитающих в естественных условиях в первый раз 21. Эти достижения позволяют изучать нейронные белки с УААН в их родной клеточной среде.
Внутренне выпрямления калиевого канала Kir2.1 сильный выпрямитель , который проходит K + токи более легко , чем в из клетки, и это имеет важное значение в регуляции физиологических процессов , в том числе возбудимости клеток, сосудистого тонуса, частоты сердечных сокращений, повторноеNAL поток соли и инсулин – релиз 22. Сверхэкспрессия Kir2.1 hyperpolarizes мембранного потенциала мишени нейрона, который становится менее возбудимой 23,24. Для того, чтобы оптически контролировать Kir2.1 в своих родных клеток, Кан и др. Генетически заложенная фото реагирующих Uaa в Kir2.1 экспрессируется в клетках млекопитающих, нейронов и эмбриональных мозга мыши 21. Краткий импульс света был способен преобразовывать UAA в природной аминокислоты цистеина, таким образом, активации целевого Kir2.1 белка. Когда было высказано это фото-индуцируемый белок канала внутрь выпрямления калия (Pirk) в гиппокампа крысы первичных нейронов, она подавлена нейронов стрельбы в ответ на световой активации. Кроме того, было выражено канал Pirk в эмбриональном неокортекса мыши, и измеряли свет активированного Pirk тока в корковых нейронов. Успешное внедрение технологии UAA в естественных условиях в головном мозге млекопитающих открывает дверь в оптически контролировать нейронные белкив их родной среде, что позволит оптической рассечение нейрональных процессов и механизмов на молекулярном уровне.
В этом протоколе мы опишем процедуры генетической включения УААН в первичных нейронов в культуре , так и в эмбриональном мозге мышей в естественных условиях. Фоточувствительных Uaa Cmn и Kir2.1 используются для иллюстрации процесса. Методы оценки успешного UAA включения и оптический контроль нейрональной активности белка предусмотрены. Этот протокол обеспечивает четкое руководство генетически кодирующий УААН в нейронах и в естественных условиях, а также оптически регулирующие функции нейронов белка с помощью фоточувствительных UAA. Мы ожидаем , что этот протокол для содействия принятию технологии UAA в естественных условиях для нейробиологии и оптогенетика биологических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для достижения эффективного фото-модуляции, важный начальный шаг должен решить, где включить фоточувствительных UAA в белка-мишени. Структурно-функциональная информация целевого белка очень полезно, чтобы служить ориентиром при выборе возможных участков. В то же время, цель Светорегул…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. 생화학. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
