Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
Geleneksel elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında, photostimulation örneklerinin fizyolojik sisteme en az müdahale ile daha zamansal ve uzamsal çözünürlük sunuyor. 1971 1 nöronların teşvik etmek lazerler kullanarak gösteri yana birçok yaratıcı yollar dışsal olarak ışık ile nöronal aktiviteyi kontrol etmek icat edilmiştir. Photocaged agonistlerin Optik sürümü uzun ligandlar 2,3,4 nöronal ağ fizyolojik yanıtı incelemek için kullanılır olmuştur. Bu teknik sayesinde kafesli agonistlerin difüzyon özgünlüğü sınırlıdır. Genetik özgünlüğü ektopik ifade ışığa duyarlı opsin kanalları ile elde ve 5,6,7 pompalar ve başarıyla çeşitli model organizmaların seçilen nöron ağları modüle uygulanmıştır edilir. Bununla birlikte, diğer proteinlere opsin proteinlerden photoresponsiveness aşılama için, optik olarak çeşitli diğer nöronal proteinlerin kontrol etmek için bu yöntemi uygulamak zor olacaktır olacağını gerÇalışmanın altında proteinin doğal özelliklerini değiştirebilir yoğun mühendislik gerektiren d. Kimyasal olarak bir proteine bir ekzojen ışığa ligand kanal proteinlerinin 8,9,10 işlevselliğini kontrol etmek için başka bir yol göstermiştir hayvan zinciri. Ligand sunulan veya azobenzen yarımının fotoizomerleşme yoluyla protein bağlama sahasına geri çekilir. Bağ kimyası hücre tarafı ve hücre içi proteinleri hariç temel olarak zar proteinlerinin hücre dışı tarafına uygulanmasını kısıtlar.
Işığa duyarlı UAAS, proteinler dahil edildikten sonra, ışık proteinleri işlemek için genel bir strateji sunar. Photocaged UAAS kendi yapı-işlev ilişkilerinin 12,13,14 ileri düzeyde tanıyorsanız membran reseptörleri ve iyon kanalları 11, içine UAAS dahil etmek Xenopus oosit içine mikroenjeksiyon edildi erken çabalarında, tRNAs kimyasal asile.Bu mikroenjeksiyon yaklaşım esas olarak büyük oosit ile sınırlıdır. Bir UAA'nın Genetik birleşme canlı hücreleri 15,16,17,18 endojen protein çeviri yoluyla UAA içeren bir dikey tRNA / sentetaz çifti kullanarak tRNA asilleme ve mikroenjeksiyon teknik açıdan zor atlar. Nöronal proteinlere UAA birleşme birincil nöronlar ve nöral kök hücreler 19,20 ortaya konmuştur. Daha yakın zamanda, ışığa cevap UAA genetik ilk kez 21 in vivo memeli beyninde nöronal protein içine dahil edilmiştir. Bu gelişmeler kendi ana hücresel ortamda UAAS ile nöronal proteinler incelemek mümkün kılar.
Içe doğru doğrulan potasyum kanal Kir2.1 hücre dışına daha içine daha kolay K + akımları geçer güçlü bir doğrultucu olduğunu ve hücre uyarılabilirliği, damar tonusu, kalp atım hızı, yeniden dahil fizyolojik süreçleri düzenleyen esastırnal tuz akışı ve insülin 22 bırakın. Kir2.1 overekspresyonu az uyarılabilir 23,24 olur hedef nöron, membran potansiyelini hiperpolarize. Optik olarak doğal hücrelerde Kir2.1 kontrol etmek için, Kang ve diğ., Genetik olarak Kir2.1 bir foto-duyarlı bir UAA memeli hücreleri, nöronlar ve embriyonik fare beyinleri 21 olarak ifade dahil. ışık kısa bir darbe böylece hedef Kir2.1 proteini aktive doğal bir amino asit Cys içine UAA dönüştürmek mümkün oldu. Bu foto-uyarılabilir içeri doğru rektifiye potasyum (Pirk) kanal proteini sıçan hipokampal primer nöron ifade edildiğinde, ışık aktivasyonuna yanıt olarak nöronal ateşleme bastırılır. Buna ek olarak, Pirk kanalı embriyonik fare neokorteks ifade edildi ve kortikal nöronlar ışık aktif Pirk akımı ölçülmüştür. Memeli beyninde in vivo UAA teknolojisinin başarılı bir şekilde uygulanması optik nöronal proteinleri kontrol etmek için kapıyı açarkendi doğal ortamında, moleküler düzeyde nöronal işlemleri ve mekanizmalarının optik diseksiyon sağlayacak olan.
Bu protokolde, kültür ve in vivo olarak embriyonik fare beyninde primer nöronlara UAAS genetik dahil edilmesi için işlemleri açıklar. ışığa cevap UAA CMN ve Kir2.1 sürecini göstermek için kullanılır. Yöntem başarılı UAA katılmasını ve sağlanan nöronal protein aktivitesinin optik kontrolünü değerlendirmek için. Bu protokol, genetik olarak nöronlar ve in vivo UAAS kodlayan ve optik da ışığa UAA ile nöronal protein fonksiyonunu düzenlemek için açık bir kılavuz sağlar. Biz bu protokol nörobilim ve optogenetic biyolojik çalışmalar için in vivo UAA teknolojisinin benimsenmesini kolaylaştırmak için bekliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etkili fotoğraf modülasyon elde etmek için, önemli ilk adımdır nerede hedef protein ışığa cevap UAA'yı dahil etmek karar vermektir. hedef proteinin yapısal ve işlevsel bilgiler aday sitelerin seçimi rehberlik çok yararlıdır. Aynı zamanda, hafif yönetmeliğin amacı en uygun hangi site belirleyecek. Aday siteleri seçtikten sonra, biz birincil nöronlar ve in vivo geçmeden önce İnsan Embriyonik Böbrek (HEK) kolay kültür ve manipülasyon için hücreler gibi memeli hücre hatlarında …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. 생화학. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O’Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O’Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen’s syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
