ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御
Summary
Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.
Abstract
Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.
Introduction
従来の電気刺激に比べて、光刺激は、検体の生理学的システムへの干渉が最小と大きな時間的、空間分解能を提供しています。 1971年1でニューロンを刺激するためにレーザーを使用してのデモンストレーション以来、多くの創造的な方法は、外因的に光で神経活動を制御するために発明されています。フォトケージアゴニストの光学リリースが長いリガンド2,3,4への神経回路網の生理学的応答を研究するために使用されています。この技術は、ケージドアゴニストの拡散に起因する特異性が限られています。遺伝子特異性は、異所的に発現している感光性オプシンチャネルによって達成さ5,6,7ポンプ 、正常に多様なモデル生物における選択された神経回路網を調節するために適用されているされています。しかし、他のタンパク質へのオプシンタンパク質からの光応答をグラフトするため、光学的に、様々な他のニューロンタンパク質を制御するためにこの方法を適用することは困難であろうwoul検討中のタンパク質の天然の特性を変更することができる強烈なエンジニアリングを必要とdは。化学的にタンパク質の外因性の感光性リガンドがチャネルタンパク質8,9,10の機能を制御する別の方法を示した係留。リガンドが提示またはアゾベンゼン部分の光異性化を介してタンパク質の結合部位から引き抜かれます。テザリング化学は、細胞内側面と細胞内タンパク質を除き、主に膜タンパク質の細胞外側への適用を制限します。
光応答Uaasは、タンパク質に組み込まれた後、光を有するタンパク質を操作するための一般的な戦略を提供します。初期の努力では、化学的にフォトケージUaasでアシル化したtRNAは、その構造と機能の関係12,13,14の理解を進めてきた膜受容体およびイオンチャネル11へUaasを組み込むためにアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションしました。このマイクロインジェクション法は、主に大規模な卵母細胞に限定されています。 UAAの遺伝的取り込みは、生細胞15,16,17,18における内因性タンパク質の翻訳を介してUAAを組み込んだ直交tRNA /シンテターゼ対を使用して技術的に困難のtRNAアシル化およびマイクロインジェクションをバイパスします。神経タンパク質へUAAの取り込みは、一次ニューロンおよび神経幹細胞19,20に実証されています。最近では、光応答UAAは、遺伝的に初めて21 in vivoでの哺乳類の脳内の神経タンパク質に組み込まれています。これらの進歩は、それらの天然の細胞環境にUaasと神経細胞のタンパク質を研究することを可能にします。
内向き整流カリウムチャネルKir2.1は、細胞の外よりにより容易にK +電流を通過させる強力な整流器であり、細胞の興奮性、血管緊張、心拍数、再を含む生理学的プロセスを調節するのに不可欠です最終塩の流れとインスリン放出22。 Kir2.1の過剰発現は少なく、興奮23,24となるターゲットニューロンの膜電位を高分極します。カンら 、そのネイティブの細胞におけるKir2.1光学的に制御する。Kir2.1への遺伝的に組み込まれた光応答性UAAは、哺乳動物細胞、神経細胞および胚性マウス脳21で表しました。光の短いパルスは、このようにターゲットKir2.1タンパク質を活性化する、天然アミノ酸のCysにUAAを変換することができました。この写真誘導性内向き整流カリウム（PIRK）チャネルタンパク質は、ラット海馬初代神経細胞で発現させた場合には、光活性化に応答してニューロンの発火を抑制しました。また、PIRKチャネルは、胚性マウス新皮質で発現させ、皮質ニューロンにおける光活性PIRK電流を測定しました。哺乳類の脳におけるインビボでのUAA技術の実装を成功させるには、光学的にニューロンタンパク質を制御するための扉を開きます彼らのネイティブ環境で、分子レベルでの神経細胞のプロセスとメカニズムの光学解剖を可能になります。
このプロトコルでは、文化およびin vivoでのマウス胎児の脳内の主要なニューロンへUaasの遺伝子組み込みのための手順について説明します。光応答UAA CMNとKir2.1処理を説明するために使用されます。成功UAA取り込みおよび神経タンパク質活性の光制御を評価するための方法が提供されます。このプロトコルは、遺伝的に神経細胞およびin vivoで Uaasをコードする、および光学的に光応答UAAを介した神経タンパク質の機能を調節するために明確なガイドを提供します。私たちは、このプロトコルは、神経科学と光遺伝学、生物学的研究のためのin vivoでの UAA技術の採用を促進することを期待しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
効果的な光変調を実現するために、重要な最初のステップは、ここで標的タンパク質に光応答UAAを組み込むことを決定することです。標的タンパク質の構造的および機能的情報は、候補サイトの選択を導くために非常に有用です。これと同時に、光調節の目的は、最も適しているサイト決定するであろう。候補地を選択した後、私たちは、一次ニューロンへとin vivoで進める前に、この…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).
Materials
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 |
| Dissecting Knife – Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
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