Optisk Kontroll av en neuronal Protein Ved hjelp av en genetisk kodet Unaturlig Amino Acid i nevroner

Summary

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Abstract

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K⁺ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Introduction

Sammenlignet med vanlig elektrisk stimulering, photostimulation gir større tidsmessig og romlig oppløsning med minimum forstyrrelse til den fysiologiske system av prøver. Siden demonstrasjonen for å bruke lasere for å stimulere nevroner i 1971 ^en, har mange kreative måter blitt oppfunnet for å eksogent kontrollere neuronal aktivitet med lys. Optisk frigivelse av photocaged agonister har lenge vært brukt til å studere fysiologiske responsen av den neuronale nett til ligander ^2,3,4. Denne teknikk har begrenset spesifisitet på grunn av diffusjon av bur agonister. Genetisk spesifisitet oppnås ved ectopically uttrykker lyssensitive opsin kanaler og pumper ^5,6,7, og det har blitt brukt til å modulere utvalgte nevrale nettverk i ulike modellorganismer. Men det ville være vanskelig å anvende denne metoden til optisk kontrollere ulike andre nevrale proteiner, siden pode photoresponsiveness fra opsin proteiner til andre proteiner would krever intens teknikk som kan endre de naturlige egenskapene til proteinet under studien. Kjemisk tethering en eksogen lysfølsomme ligand til et protein har vist en annen måte å kontrollere funksjonaliteten til kanalproteiner ^8,9,10. Liganden er presentert eller trukket tilbake fra bindingssetet av proteinet ved fotoisomerisering av azobenzen del. -Deling kjemi begrenser anvendelsen hovedsakelig til den ekstracellulære siden av membranproteiner, med unntak av den intracellulære side og intracellulære proteiner.

Fotoreager Uaas, etter å ha blitt innlemmet i proteiner, gir en generell strategi for å manipulere proteiner med lys. I tidlig innsats, tRNAs kjemisk acylert med photocaged Uaas ble microinjected inn Xenopus oocytter å innlemme Uaas til membranreseptorer og ionekanaler ^11, som har avansert forståelse av deres struktur-funksjon relasjoner ^12,13,14.Denne mikroinjeksjon tilnærmingen er i hovedsak begrenset til store oocytter. Genetisk inkorporering av en UAA forbigår teknisk utfordrende tRNA acylering og mikroinjeksjon ved hjelp av en ortogonal tRNA / syntetase paret, som inkorporerer UAA gjennom endogent protein oversettelse i levende celler ^15,16,17,18. UAA innlemmelse i nevronale proteiner har blitt demonstrert i primær nevroner og nevrale stamceller ^19,20. Mer nylig har fotoreager UAA blitt genetisk inkorporert i en neuronal protein i pattedyrhjernen in vivo for første gang ^21. Disse fremskritt gjør det mulig å studere nevrale proteiner med Uaas i sitt eget mobilnettet miljø.

Innad he kaliumkanal Kir2.1 er en sterk likeretter som passerer K ⁺ strømmer lettere inn i enn ut av cellen, og det er avgjørende i regulering av fysiologiske prosesser, inkludert celleeksiterbarhet, vaskulær tone, hjertefrekvens, renal salt flyt og insulin slipper ^22. Overekspresjon av Kir2.1 hyperpolarizes membranpotensialet av målet nervecellen, som blir mindre opphisset ^23,24. Å optisk kontrollere Kir2.1 i sin opprinnelige celler, Kang et al. Genetisk innarbeidet en foto-responsive UAA inn Kir2.1 uttrykt i pattedyrceller, nevroner og embryonale mus hjerner ^21. En kort lyspuls var i stand til å omdanne UAA til en naturlig aminosyre Cys, og dermed aktivisere målet Kir2.1 protein. Når dette bildet-induserbar innvendig he kalium (Pirk) kanal protein ble uttrykt i rotte hippocampus primære nevroner, det undertrykte nevronal utløsning i respons til lys aktivering. I tillegg ble pilken kanal uttrykt i embryonale muse neocortex, og den lys-aktivert pilken strøm i kortikale neuroner ble målt. Den vellykkede gjennomføringen av UAA teknologi in vivo i pattedyrhjernen åpner døren til optisk kontrollere nevrale proteineri sitt opprinnelige miljø, noe som vil gjøre det mulig optisk disseksjon av nevrale prosesser og mekanismer på molekylært nivå.

I denne protokollen beskriver vi prosedyrer for genetisk innblanding av Uaas inn i primære nevroner i kultur og i embryonale mus hjernen in vivo. Den fotoreager UAA Cmn og Kir2.1 brukes til å illustrere prosessen. Metoder for å vurdere vellykket UAA innlemmelse og optisk kontroll av neuronal protein aktivitet er gitt. Denne protokollen gir en klar guide til genetisk kodende Uaas i nerveceller og in vivo, og for å regulere optisk neuronal protein funksjon via et fotoreagerende UAA. Vi forventer at denne protokollen for å lette vedtakelsen av in vivo UAA teknologi for nevrovitenskap og optogenetic biologiske studier.

Protocol

Alle prosedyrer i denne studien ble utført ved hjelp av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjente protokoller for dyr håndtering ved Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA. 1. UAA innbygging i Kir2.1 og Expression av den resulterende Pirk i Primær Neuronal Culture DNA Construction Velg et målområde for Kir2.1 for UAA innlemmelse. Utnytte tidligere kunnskap og informasjon om struktur og funksjon av Kir2.1, slik at den valgte området m…

Representative Results

Å genetisk innlemme en UAA inn et protein i nerveceller, er det første viktige skrittet å utforme passende genkonstruksjoner å levere og uttrykke gener effektivt i nerveceller. Det finnes tre genetiske komponenter for UAA innlemmelse: (1) målgenet med TAG rav stoppkodonet innført ved det valgte stedet for UAA inkorporering (2) en ortogonal tRNA til å gjenkjenne den muterte TAG stoppkodon, og (3) en ortogonal aminoacyl -tRNA syntetase å lade UAA på ortogonale tRNA. Hver komponent…

Discussion

For å oppnå effektiv foto-modulasjon, er det viktig første skritt for å bestemme hvor du skal innlemme fotoreager UAA i målet protein. Strukturell og funksjonell informasjon av målproteinet er meget nyttig for å lede valget av kandidatwebområder. På samme tid, ville den hensikt å lette regulering bestemme hvilken side som er mest egnet. Når du har valgt kandidat nettsteder, anbefaler vi å teste nettsteder i pattedyrcellelinjer som humane embryonale nyre (HEK) celler for enklere kultur og manipulasjon, før d…

Materials

Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769
Iris Spatula-curved	Fine Science Tool	10092-12
Dissecting Knife – Fine Angled Tip	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Supplement	Life Technologies	35050-061
MITO+ Serum Extender	BD Biosciences	355006
Falcon 40 µm Cell Strainer	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)	Sigma-Aldrich	B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385	Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade	Promega	V2111