संवहनी endothelial वृद्धि कारकों की मूल्यांकन के लिए एक सरल Bioassay
Summary
हम पता लगाने बढ़ाता है और ligands के संवहनी endothelial वृद्धि कारक परिवार के सदस्यों की गतिविधि की निगरानी के लिए एक साधारण सेल आधारित bioassay का वर्णन है। परख एक कारक पर निर्भर सेल लाइन में व्यक्त chimeric रिसेप्टर्स का उपयोग करता ligand द्वारा रिसेप्टर बंधन और पार से जोड़ने की एक अर्द्ध मात्रात्मक या मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करने के लिए।
Abstract
रिसेप्टर tyrosine kinases और उनकी बातचीत ligands संवहनी जीव विज्ञान में शामिल के विश्लेषण से संबंधित रिसेप्टर्स, संबंधित ligands के एक विस्तृत रेंज और विशेष endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों के साथ काम करने की कठिनाई के परिवारों के विधान अभिव्यक्ति के कारण अक्सर चुनौतीपूर्ण है। यहाँ हम संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR -2), संकेत है कि angiogenesis और lymphangiogenesis को बढ़ावा देने का एक प्रमुख ट्रांसड्यूसर को ligands का पता लगाने के लिए एक bioassay का वर्णन है। एक सीडीएनए transmembrane और erythropoietin रिसेप्टर (EpoR) के cytoplasmic क्षेत्रों के साथ VEGFR -2 के बाह्य (ligand बाध्यकारी) क्षेत्र के एक संलयन एन्कोडिंग कारक पर निर्भर सेल लाइन बीए / F3 में व्यक्त किया जाता है। यह सेल लाइन 24 घंटा के भीतर कोशिकाओं की मौत में इंटरल्यूकिन 3 (आईएल 3) और इस पहलू परिणामों की वापसी की उपस्थिति में होती है। VEGFR-2 / EpoR रिसेप्टर संलयन की अभिव्यक्ति एक वैकल्पिक व्यवस्था अस्तित्व और क्षमता को बढ़ावा देने के लिए प्रदान करता हैएक ligand बंधन और संलयन प्रोटीन (यानी, एक है कि कर सकते हैं पार से लिंक VEGFR -2 बाह्य क्षेत्र) के बाह्य भाग पार से जोड़ने के लिए सक्षम की उपस्थिति में स्थित होकर ट्रांसफ़ेक्ट बीए / F3 कोशिकाओं के प्रसार lly। एक अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण जिसमें ligand और कोशिकाओं की छोटी मात्रा में 24 घंटा में तेजी से परिणाम की अनुमति है, और एक मात्रात्मक एक व्यवहार्य सेल नंबर के किराए की मार्कर से जुड़े दृष्टिकोण: परख दो तरीकों से किया जा सकता है। परख प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, ज्ञात VEGFR -2 ligands के लिए अत्यधिक संवेदनशील है और VEGFR -2 ऐसे रिसेप्टर या ligands, और घुलनशील ligand जाल को मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में संकेत के बाह्य अवरोधकों को समायोजित कर सकते हैं।
Introduction
secreted प्रोटीन वृद्धि कारक है और उनके आत्मीय कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) परिवार घुलनशील ligands और झिल्ली एम्बेडेड रिसेप्टर्स, सेलुलर झिल्ली भर संकेतों transducing में क्रमश कि समारोह का एक महत्वपूर्ण और विविध समूह है। वे endothelial कोशिकाओं में भी, लेकिन उपकला मूल की कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2 के उन लोगों में मुख्य रूप से कार्य करते हैं। उन्हें निशाना बना ligand सक्रिय वीईजीएफ़ रिसेप्टर्स (VEGFRs) जैसे उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन और कैंसर के रूप में प्रमुख विकृतियों, में महत्वपूर्ण हैं, और चिकित्सा विज्ञान से लगे हुए रास्ते संकेतन लगातार नैदानिक उपयोग में हैं (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी bevacizumab कि वीईजीएफ़-ए लक्ष्य) 3,4।
वीईजीएफ़ परिवार की जटिलताओं से एक प्रकृति में मौजूद घुलनशील ligands (वीईजीएफ़-ए, वीईजीएफ़-बी, वीईजीएफ़-सी, वीईजीएफ़-डी, प्रोटीन वीईजीएफ़ parapox वायरस परिवार ओआरएफ और सांप के जहर वीईजीएफ़, के अलावा अन्य द्वारा इनकोडिंग की विविधता है निरोधात्मकवीईजीएफ़-ए) 2 के isoforms।
ये ligands रिसेप्टर tyrosine काइनेज परिवार के तीन सदस्यों, अर्थात् VEGFR -1, VEGFR -2 और VEGFR-3 के साथ बातचीत। इन रिसेप्टर्स अस्थायित्व विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर व्यक्त कर रहे हैं, लेकिन endothelial कोशिकाओं है कि सभी आकार 5 के रक्त और लसीका वाहिकाओं लाइन की सतह पर अक्सर सह व्यक्त कर रहे हैं। VEGFR -2 बाध्य कर सकते हैं स्तनधारी ligands वीईजीएफ़-ए 6, वीईजीएफ़-सी 7 और वीईजीएफ़-डी 8,9 के साथ ही ओआरएफ वायरस वीईजीएफ़ 10 और सांप के जहर वीईजीएफ़ 11। VEGFR -2 angiogenesis भ्रूण के विकास में (पूर्व मौजूदा जहाजों से नए रक्त वाहिकाओं के विकास), घाव भरने, कैंसर और नेत्र रोगों ड्राइविंग में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। इन संदर्भों में, इस तरह के वीईजीएफ़-ए, सी और डी के रूप में बाँध और ligands रक्त संवहनी endothelial कोशिकाओं 12-15 पर रिसेप्टर को सक्रिय करें। लसीका endothelial कोशिकाओं पर, VEGFR -2 lymphangiogenesis में एक भूमिका है, नए लसीका वाहिकाओं 16 के गठन निभाता है। VEGFR-2 भी फैलाव और स्वस्थ ऊतकों और रोग 17 में प्रमुख धमनियों और lymphatics के विस्तार को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। VEGFR -2 की पूरी समझ: ligand बातचीत इसलिए angiogenesis निर्भर रोगों 18 के उपचार में उपयोग के लिए अवरोधकों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। VEGFR-2 वीईजीएफ़-एक बाँध के सबसे isoforms, वीईजीएफ़-सी और डी के वीईजीएफ़-प्रोटिओलिटिक दरार वीईजीएफ़-अनुरूपता डोमेन कि उच्च आत्मीयता VEGFR -2 19,20 के लिए बाध्य दर्शाती से मिलकर एक टुकड़ा जारी करने के लिए आवश्यक है है।
हम जानते हैं कि प्राथमिक endothelial कोशिकाओं है, जो पारित होने के लिए तकनीकी रूप से कठिन हैं, खरीद करने के लिए महंगा और संस्कृति के लिए जरूरत नाकाम करने के लिए बनाया गया है VEGFR -2 के ligands की निगरानी के लिए एक bioassay (विशेष माध्यम की आवश्यकता होती है), 21 विकसित और कई VEGFRs एक्सप्रेस और सह जुड़े है 22 रिसेप्टर्स। अन्य वीईजीएफ़ रिसेप्टर्स या सह-रिसेप्टर्स के साथ VEGFR -2 के Heterodimerization अवांछित जटिलता पैदा कर सकता है जब संवर्धन करने के लिए लक्ष्यY बाइनरी रिसेप्टर ligand बातचीत, गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक विशिष्ट रिसेप्टर के कारण, या निरोधात्मक अभिकर्मकों के प्रभाव का आकलन। 23। bioassay कोशिका झिल्ली में प्रासंगिक रिसेप्टर की गतिशीलता बरकरार रखती है और एक ligand के लिए बाध्य करने की क्षमता और पार से लिंक VEGFR -2 बाह्य क्षेत्र के मूल्यांकन की अनुमति देता है।
bioassay एक chimeric रिसेप्टर के सृजन में जो एक वीईजीएफ़ रिसेप्टर (इस मामले VEGFR -2 में) के बाह्य क्षेत्र transmembrane और erythropoietin रिसेप्टर (EpoR), साइटोकाइन रिसेप्टर परिवार के एक सदस्य के intracellular क्षेत्रों से जुड़े हुए है पर निर्भर करता है 8,24। इस संलयन प्रोटीन तो, कारक पर निर्भर समर्थक बी सेल लाइन बीए / F3 में व्यक्त किया जाता है एक ligand बंधन और पार से जोड़ने रिसेप्टर के बाह्य डोमेन cytoplasmic प्रेरक क्षेत्र है, जो करने में सक्षम है की सक्रियता के कारण बनता में सक्षम के साथ जो उत्तेजना पर जानूस kinases (JAKs) के माध्यम से एक अस्तित्व संकेत transducing सेल को बढ़ावा देने केअस्तित्व और / या प्रसार। इसके विपरीत, पूर्ण लंबाई VEGFR-2 एक ही प्रकार की कोशिका में, और ligand के साथ उत्तेजना की अभिव्यक्ति, सेल अस्तित्व और प्रसार को बढ़ावा देने नहीं करता है, यह दर्शाता है कि VEGFR -2 मार्ग के समीपस्थ सिगनल प्रभावोत्पादक इस प्रकार की कोशिका में उपलब्ध नहीं हैं।
हम संदर्भों की एक किस्म में परख का इस्तेमाल किया है उपन्यास VEGFR -2 ligands 10,19,20,24-29 के बंधन पता लगाने के लिए। एक VEGFR-3-EpoR-बीए / F3 परख के साथ संयोजन में, हम बंधन और पार से जोड़ने VEGFR -2 और VEGFR-3 30 के लिए वीईजीएफ़-सी के सापेक्ष गतिविधियों और वीईजीएफ़-डी में वृद्धि कारकों की तुलना में है। परख VEGFR -2 या वीईजीएफ़-डी, घुलनशील VEGFR -2 जाल और वीईजीएफ़ परिवार 31 को लक्षित करने के लिए peptidomimetics मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने की निरोधात्मक गतिविधि को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परख भी प्राथमिक endothelial कोशिकाओं में अलग ओआरएफ वायरस तनाव से VEGFs की क्षमता को बाध्य करने के लिए और पार से लिंक VEGFR -2 का परीक्षण करने से पहले दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था <s> 10,26 अप। परख VEGFs की म्यूटेंट की तेजी से जांच जल्दी गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जा सकता से पहले वे अधिक श्रमसाध्य endothelial सेल assays 25 या जब सफ़ाई के विकास के लिए आकलन प्रोटोकॉल कारकों 27 के लिए पेश कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
परख का वर्णन हम प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और अर्द्ध मात्रात्मक संस्करण त्वरित निर्धारण कि कभी कभी जब उत्पादन या वृद्धि कारक है, एंटीबॉडी या अन्य प्रयोगों के लिए घुलनशील रिसेप्टर डोमेन की शुद्धि की निगरानी के लिए आवश्यक हैं के लिए अनुमति देता है। परख के उपयोग में आसानी यह प्राथमिक endothelial विशिष्ट ऊतकों या अंग प्रणालियों से रक्त या लसीका वाहिकाओं से ली गई कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन आगे और अधिक पूरा अध्ययन करने के लिए एक आदर्श पूरक बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परख यहाँ वर्णित है, जो विकास के कारकों पर निर्भर कर रहे हैं उच्च व्यवहार्यता की कोशिकाओं, के प्रयोग पर निर्भर करता है। कोशिकाओं इसलिए सुनिश्चित करें कि वे कारक पर निर्भर हैं, और कैमेरिक रिसेप्टर की अभि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
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