Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell'endotelio vascolare
Summary
Descriviamo un semplice test su cellule-base per la rilevazione, la quantificazione e il monitoraggio dell'attività dei membri della famiglia endoteliale vascolare del fattore di crescita dei leganti. Il saggio utilizza recettori chimerici espressi in una linea cellulare fattore dipendente per fornire una valutazione semiquantitativa o quantitativa di legame recettoriale e reticolazione del legante.
Abstract
L'analisi del recettore tirosina chinasi e loro ligandi interagiscono coinvolti nella biologia vascolare è spesso difficile a causa l'espressione costitutiva di famiglie di recettori correlati, una vasta gamma di ligandi correlate e la difficoltà di trattare con colture primarie di cellule endoteliali specializzate. Qui si descrive un saggio biologico per la rivelazione di ligandi per il fattore di crescita vascolare endoteliale receptor-2 (VEGFR-2), un trasduttore chiave di segnali che promuovono l'angiogenesi e lymphangiogenesis. Un cDNA codificante una fusione della regione extracellulare (ligando vincolante) di VEGFR-2 con l'transmembrana e citoplasmatici regioni del recettore dell'eritropoietina (EpoR) è espressa nella linea cellulare fattore dipendente Ba / F3. Questa linea cellulare cresce in presenza di interleuchina-3 (IL-3) e il ritiro di questo fattore risultati nella morte delle cellule entro 24 ore. L'espressione della / EpoR di fusione del recettore VEGFR-2 fornisce un meccanismo alternativo per promuovere la sopravvivenza e potentially proliferazione delle cellule Ba / F3 trasfettate stabilmente in presenza di un legante capace di legare e reticolazione della porzione extracellulare della proteina di fusione (ad esempio, uno che può attraversare-link regione extracellulare VEGFR-2). L'analisi può essere eseguita in due modi: un approccio semi-quantitativo, in cui piccoli volumi di ligando e cellule permettono un rapido risultato in 24 ore, e un approccio quantitativo coinvolge indicatori surrogati di un numero di cellule vitali. Il saggio è relativamente facile da eseguire, è altamente sensibile alle note VEGFR-2 leganti e può ospitare inibitori extracellulari di VEGFR-2 segnalazione come gli anticorpi monoclonali per il recettore o leganti e trappole ligando solubile.
Introduction
Il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) famiglia di fattori di crescita proteina secreta e le loro cognate recettori della superficie cellulare è un gruppo importante e diversificata di ligandi solubili e recettori di membrana-embedded, rispettivamente, tale funzione in trasduzione dei segnali attraverso le membrane cellulari. Essi funzionano principalmente nelle cellule endoteliali, ma anche in cellule di origine epiteliale e quelli del 1,2 sistema immunitario. Vie di segnalazione impegnati dai recettori ligando-attivato VEGF (VEGFRs) sono fondamentali in importanti patologie, come la degenerazione maculare senile e il cancro, e terapeutica loro rivolte sono in uso clinico frequente (per esempio, il bevacizumab anticorpo monoclonale che ha come bersaglio il VEGF-A) 3,4.
Una delle complessità della famiglia VEGF è la diversità di ligandi solubili presenti in natura (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, proteine VEGF codificate dal ORF famiglia di virus parapox e veleno di serpente VEGF, più altri inibitorioisoforme di VEGF-A) 2.
Questi ligandi interagiscono con tre membri della famiglia dei recettori tirosin-chinasi, cioè VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Questi recettori sono variabilmente espressi su differenti tipi cellulari, ma sono spesso co-espressi sulla superficie delle cellule endoteliali che rivestono sanguigni e linfatici navi di tutte le dimensioni 5. VEGFR-2 può legare l'mammiferi ligandi VEGF-A 6, VEGF-C 7 e VEGF-D 8,9, così come virus orf VEGF 10 e veleno di serpente VEGF 11. VEGFR-2 svolge un ruolo importante nel guidare l'angiogenesi (la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti) nello sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, il cancro e le malattie degli occhi. In questi contesti, leganti quali VEGF-A, -C e -D legano e attivano il recettore sulla sangue vascolare cellule endoteliali 12-15. Sulle cellule endoteliali linfatiche, VEGFR-2 svolge un ruolo nella linfangiogenesi, la formazione di nuovi vasi linfatici 16. VEGFR-2 può anche promuovere la dilatazione e l'espansione delle grandi arterie e vasi linfatici nei tessuti sani e malattie 17. Una comprensione completa di VEGFR-2: interazioni ligando è quindi importante per lo sviluppo di inibitori per l'uso nel trattamento di malattie angiogenesi-dipendenti 18. Mentre la maggior parte isoforme di VEGF-A si legano a VEGFR-2, taglio proteolitico di VEGF-C e VEGF-D è necessario per rilasciare un frammento consistente del dominio VEGF-omologia che presenta alta affinità di legame al VEGFR-2 19,20.
Abbiamo sviluppato un saggio biologico per monitorare ligandi di VEGFR-2 che è stato progettato per aggirare la necessità di cellule primarie endoteliali, che sono tecnicamente difficili da passare, costoso per l'acquisto e la cultura (che richiede media specializzati) 21 e di esprimere molteplici VEGFRs e co-associato recettori 22. Eterodimerizzazione di VEGFR-2 con altri recettori del VEGF o co-recettori può causare complessità indesiderate quando si punta a pernointerazioni y binari recettore-ligando, valutando l'attività attribuibili a uno specifico recettore, o valutare l'effetto dei reagenti inibitori. 23. Il saggio biologico mantiene la mobilità del recettore rilevante nella membrana cellulare e permette la valutazione della capacità di un ligando di legare e cross-link regione extracellulare VEGFR-2.
Il saggio biologico si basa sulla creazione di un recettore chimerico in cui la regione extracellulare di un recettore VEGF (in questo caso VEGFR-2) è fuso al transmembrana e regioni intracellulari del recettore dell'eritropoietina (EpoR), un membro della famiglia dei recettori delle citochine 8,24. Questa proteina di fusione viene poi espressa nella linea cellulare pro-B fattore dipendente Ba / F3, su cui stimolazione con un ligando capace di legare e reticolare il dominio extracellulare del recettore provoca l'attivazione della regione effettore citoplasmatica, capace di trasduzione un segnale di sopravvivenza via Janus chinasi (JAK) per la promozione delle cellulesopravvivenza e / o proliferazione. In contrasto, l'espressione di full-length VEGFR-2 nello stesso tipo cellulare, e stimolazione con ligando, non promuovono la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, indicando che gli effettori segnalazione prossimali del pathway VEGFR-2 non sono disponibili in questo tipo cellulare.
Abbiamo usato il test in una varietà di contesti di esplorare vincolante di nuove VEGFR-2 ligandi 10,19,20,24-29. In combinazione con un saggio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, abbiamo confrontato le relative attività di VEGF-C e fattori di crescita VEGF-D per legare e reticolazione VEGFR-2 e VEGFR-3 30. Il test è stato utilizzato per caratterizzare l'attività inibitoria di anticorpi neutralizzanti monoclonali di VEGFR-2 o VEGF-D, solubili VEGFR-2 trappola e peptidomimetici rivolte alla famiglia del VEGF 31. Il dosaggio è stato utilizzato anche per mostrare la capacità di VEGF da diversi ceppi di virus orf di legare e cross-link VEGFR-2 prima della prova in cellule endoteliali primarie <sup> 10,26. Il test è particolarmente utile per lo screening rapido di mutanti di VEGF che possono essere rapidamente valutati per l'attività prima della loro introduzione ai saggi cellulari endoteliali più laboriose 25 o quando i protocolli valutare per la crescita purificante fattori 27.
Il test che descriviamo è facile da eseguire, e la versione semi-quantitativa permette determinazioni veloci che a volte sono necessari quando il monitoraggio della produzione o purificazione di fattori di crescita, anticorpi o domini recettore solubile per altri esperimenti. La facilità d'uso del test lo rende un complemento ideale per studi ulteriori e più complete eseguite con le cellule endoteliali primarie derivate da sangue o vasi linfatici da specifici tessuti o organi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test qui descritto si basa sull'utilizzo di cellule di alta redditività, che dipendono da fattori di crescita. Le cellule devono quindi essere attentamente colta per assicurare che siano fattore-dipendente, e mantenere l'espressione del recettore chimerico. Garantire che il mezzo è preparata e non conservati per un periodo di tempo eccessivamente lungo e che WEHI-3D CM è molto attivo è importante. Le cellule devono essere accuratamente lavati da IL-3 contenente media nel terreno di coltura per garan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
