والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو
Summary
نحن تصف الأحيائي القائم على خلية بسيط للكشف، قياس ورصد النشاط من أعضاء البطانية الأسرة عامل نمو الأوعية الدموية بروابط. يستخدم فحص مستقبلات خيالية أعرب في خط الخلية التي تعتمد على عامل أن يقدم تقييما شبه كمي أو الكمي للمستقبلات ملزمة وعبر ربط بواسطة يجند.
Abstract
تحليل تحركات مستقبلات التيروزين وبروابط التفاعل على المشاركة في البيولوجيا الأوعية الدموية غالبا ما يكون صعبا بسبب التعبير التأسيسي للعائلات مستقبلات ذات الصلة، مجموعة واسعة من بروابط ذات الصلة، وصعوبة التعامل مع الثقافات الأولية من الخلايا البطانية المتخصصة. نحن هنا وصف الأحيائي للكشف عن بروابط إلى عامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات-2 (VEGFR-2)، محول رئيسي للإشارات التي تعزز الأوعية الدموية وlymphangiogenesis. وأعرب كدنا] ترميز الانصهار في المنطقة خارج الخلية (ملزم يجند) من VEGFR-2 مع الغشاء والمناطق هيولي من مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR) في خط الخلية التي تعتمد على عامل با / F3. ينمو هذا الخط خلية في وجود انترلوكين 3 (IL-3) والانسحاب من هذا العامل النتائج في موت الخلايا خلال 24 ساعة. التعبير عن / EpoR مستقبلات الانصهار VEGFR-2 يوفر آلية بديلة لتعزيز بقاء وامكاناتهاLLY انتشار الخلايا با / F3 ستابلي في وجود يجند قادرة على ربط وعبر ربط جزء خارج الخلية من البروتين الانصهار (أي واحد يمكن أن عبور الارتباط المنطقة خارج الخلية VEGFR-2). الفحص لا يمكن أن يؤديها بطريقتين: نهج شبه الكمية التي كميات صغيرة من يجند وخلايا تسمح نتيجة سريعة في 24 ساعة، والنهج الكمي التي تنطوي على علامات بديلة من عدد الخلايا قابلة للحياة. فحص من السهل نسبيا على القيام بها، هو استجابة للغاية أن تعرف VEGFR-2 بروابط ويمكن أن تستوعب مثبطات خارج الخلية من VEGFR-2 الإشارات مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لمستقبلات أو بروابط، والفخاخ يجند القابلة للذوبان.
Introduction
عائلة عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من عوامل النمو بروتين يفرز والمشابهة مستقبلات سطح الخلية التي هي مجموعة هامة ومتنوعة من بروابط القابلة للذوبان ومستقبلات جزءا لا يتجزأ من غشاء، على التوالي أن وظيفة في transducing إشارات عبر الأغشية الخلوية. أنها تعمل بشكل رئيسي في الخلايا البطانية ولكن أيضا في خلايا المنشأ الظهارية وتلك من 1،2 الجهاز المناعي. مسارات الإشارات تعمل بواسطة مستقبلات تنشيط يجند VEGF (VEGFRs) تعتبر بالغة الأهمية في الأمراض الرئيسية، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر والسرطان، والعلاجات التي تستهدف منهم في الاستخدام السريري المتكرر (على سبيل المثال، فإن الأجسام المضادة بيفاسيزوماب وحيدة النسيلة الذي يستهدف VEGF-A) 3،4.
واحدة من تعقيدات الأسرة VEGF هو تنوع بروابط القابلة للذوبان الموجودة في الطبيعة (VEGF-A، VEGF-B، VEGF-C، VEGF-D، والبروتينات عامل نمو بطانة الاوعية المشفرة بواسطة ORF parapox عائلة الفيروسات وسم الأفعى VEGF، بالإضافة إلى الآخر مكبحالإسوية من VEGF-A) 2.
هذه بروابط تتفاعل مع ثلاثة من أفراد عائلة مستقبلات التيروزين كيناز، وهي VEGFR-1، VEGFR-2 وVEGFR-3. يتم التعبير عن هذه المستقبلات بنسب مختلفة على أنواع مختلفة من الخلايا ولكن غالبا ما تشارك في أعربت على سطح الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية واللمفاوية من جميع الأحجام 5. VEGFR-2 يمكن ربط الثدييات بروابط VEGF-A 6، VEGF-C 7 و VEGF-D 8،9 وكذلك فيروس ORF VEGF 10 و سم الأفعى VEGF 11. VEGFR-2 يلعب دورا رئيسيا في دفع عجلة الأوعية الدموية (نمو أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا) في التطور الجنيني، التئام الجروح والسرطان وأمراض العيون. في هذه السياقات، بروابط مثل VEGF-A، -C و-D ربط وتفعيل مستقبلات على خلايا الدم بطانة الأوعية الدموية 12-15. على الخلايا البطانية اللمفاوية، يلعب VEGFR-2 دورا في lymphangiogenesis، وتشكيل الأوعية اللمفاوية الجديدة 16. VEGFR-2 يمكن أيضا أن تعزز تمدد وتوسع الشرايين والأوعية اللمفاوية الرئيسية في الأنسجة السليمة ومرض 17. فهم كامل من VEGFR-2: التفاعلات يجند غير ذلك من المهم لتطوير مثبطات لاستخدامها في علاج الأمراض التي تعتمد على الأوعية الدموية 18. في حين أن معظم الأشكال الإسوية من VEGF-A ربط لVEGFR-2، مطلوب انشقاق بروتين عامل نمو بطانة الاوعية-C وVEGF-D لاطلاق سراح جزء يتكون من المجال VEGF-التماثل التي يسلك قابلية عالية ملزما للVEGFR-2 19،20.
لقد قمنا بتطوير الأحيائي لمراقبة بروابط من VEGFR-2 التي تم تصميمها للتحايل على الحاجة إلى الخلايا الأولية البطانية، والتي يصعب من الناحية الفنية لمرور، ومكلفة لشراء والثقافة (التي تتطلب المتوسطة المتخصصة) 21 والتعبير عن VEGFRs متعددة والمشارك المرتبطة مستقبلات 22. Heterodimerization من VEGFR-2 مع مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية أخرى أو شارك في مستقبلات يمكن أن يسبب التعقيدات غير المرغوب فيه عندما تهدف إلى مسمارالتفاعلات ذ الثنائية مستقبلات يجند، وتقييم النشاط تعزى إلى مستقبلات محددة، أو تقييم أثر الكواشف المثبطة. 23. الأحيائي يحتفظ تنقل مستقبلات ذات الصلة في غشاء الخلية ويسمح تقييم قدرة يجند لربط وصلة عبر المنطقة خارج الخلية VEGFR-2.
يعتمد الأحيائي على خلق مستقبل خيالية في الذي تنصهر المنطقة خارج الخلية من مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية (في هذه الحالة VEGFR-2) إلى الغشاء والمناطق داخل الخلايا مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR)، وهو عضو في عائلة مستقبلات خلوى 8،24. ثم يتم التعبير عن هذا البروتين الانصهار في خط خلية للمحترفين-B التي تعتمد على عامل با / F3، التي التحفيز مع يجند قادرة على ربط وعبر ربط المجال خارج الخلية من مستقبلات يسبب تنشيط المنطقة المستجيب حشوية، والتي هي قادرة على من transducing إشارة البقاء على قيد الحياة عن طريق يانوس تحركات (JAKs) لتعزيز خليةالبقاء على قيد الحياة و / أو انتشار الأسلحة النووية. في المقابل، تعبيرا عن كامل طول VEGFR-2 في نفس نوع من الخلايا، والتحفيز مع يجند، لا تعزز بقاء الخلايا وانتشار، مشيرا إلى أن المؤثرات الإشارات القريبة من مسار VEGFR-2 غير متوفرة في هذا نوع من الخلايا.
وقد استخدمنا الفحص في مجموعة متنوعة من السياقات لاستكشاف ملزمة من رواية VEGFR-2 بروابط 10،19،20،24-29. في توليفة مع VEGFR-3-EpoR با / F3 فحص ذلك قمنا بالمقارنة أنشطة النسبية للVEGF-C وعوامل النمو VEGF-D للربط وعبر ربط VEGFR-2 وVEGFR-3 30. وقد استخدم الاختبار لتميز النشاط المثبطة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لVEGFR-2 أو VEGF-D، قابل للذوبان VEGFR-2 فخ وpeptidomimetics التي تستهدف الأسرة VEGF 31. تم استخدام الفحص أيضا لإظهار قدرة VEGFs من مختلف سلالات فيروس ORF إلى ربط وعبر رابط VEGFR-2 قبل الاختبار في الخلايا البطانية الابتدائية <sتصل> 10،26. الفحص مفيد بشكل خاص للفحص السريع للالمسوخ من VEGFs التي يمكن تقييمها بسرعة للنشاط قبل أن يتم إدخالها إلى أكثر شاقة المقايسات خلية البطانية 25 أو عندما بروتوكولات تقييم للنمو تنقية عوامل 27.
مقايسة وصفنا من السهل القيام بها، ونسخة شبه الكمي يسمح للقرارات سريعة مطلوبة في بعض الأحيان عندما مراقبة الإنتاج أو تنقية عوامل النمو، والأجسام المضادة أو المجالات مستقبلات للذوبان لتجارب أخرى. سهولة الاستخدام للمقايسة يجعلها عنصرا مكملا مثاليا لإجراء المزيد من الدراسات وأكثر اكتمالا القيام بها مع الخلايا البطانية الأولية المشتقة من الدم أو الأوعية اللمفاوية من أنسجة معينة أو أجهزة الجسم.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة الموصوفة هنا يعتمد على استخدام خلايا الجدوى العالية، والتي تعتمد على عوامل النمو. لذا الخلايا تحتاج إلى أن تكون تربيتها بعناية للتأكد من أنها تعتمد على عامل، والاحتفاظ بها التعبير عن مستقبلات خيالية. ضمان المتوسطة وتقدم طازجة وليس تخزينها لفترة طويلة للغاية?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
