定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
NSCLC（非小細胞肺癌）患者における低い生存率は、進行した疾患と劣る早期発見1における処理の限られた有効性の主な原因です。 NSCLC患者の亜集団で発見されたEGFR遺伝子に変異を活性化し、キナーゼ阻害剤（TKIのを）チロシンする感度を付与することが知られています。残念ながら、EGFR突然変異したNSCLC患者の大多数は、TKI抵抗2を開発します 。特にこの文脈で、正しい診断が必須です。一般的に、による腫瘍の局在化を、NSCLCにおける生検組織を得ることは必ずしも可能ではありません。したがって、いくつかの研究は、これらの生物学的データを得るために、非侵襲的な方法を使用することを進行中です。エキソソームは、非侵襲的技術3と診断および予後値を得るために調査することができる液体生検成分として記載されています。
Eの – （100 nmの直径40）エキソソームはnanovesiclesあります生理学的および病理学的条件4の両方の異なる種類の細胞によって放出されるndocytic起源。彼らは、タンパク質、脂質、mRNAおよびマイクロRNAを運ぶことができます。また、いくつかの研究は、腫瘍細胞、血管形成、間質および細胞外マトリックスリモデリングおよび薬剤耐性5の成長と生存に影響を与えることができる腫瘍由来エキソソームの多面的な役割を示唆しています。
マイクロRNA（miRNA）は、転写後調節に関与している短い非コードRNA、標的mRNAの3'-UTRを結合し、劣化または非翻訳6にするmRNAをリードしています。エキソソームへのmiRNAの選択ソーティングが記載されています。この文脈では、最近、 インビトロおよびインビボで 、クルクミン処理7後の慢性骨髄性白血病細胞株によって放出エキソソームにおけるmiR-21の選択的な包装（発癌性効果を有する周知のmiRNA）を実証しました。
ザエキソソームmiRNAプロファイルは、原発腫瘍のmiRNAプロファイルと類似しており、この機能は、早期診断および予後3で利用することができます。具体的には、リアルタイムPCRによって、特徴付ける可能性があり、疾患の分子プロフィールと相関選択されるmiRNA 例えば 、他の8間のEGFR突然変異。
ここでは、NSCLC相関するmiRNA 8-9の選択されたパネルの分析は、NSCLC患者の血液中に放出されたエキソソームから単離したことが記載されています。患者からのお知らせ同意レポートを取得した後、12 NSCLC患者と6健常対照のプラズマ、分析しました。エキソソームの単離は、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて行きました。エキソソーム単離の前に、血漿試料を汚染物質の循環miRNAを分解するために、RNアーゼで処理しました。我々は、他のテクニックの制限された標準化に市販のキットを使用してこの分析を実行することを決定しましたQUES（ 例えば 、超遠心分離）臨床試料を扱うときに特に重要です。このキットは、RNA分解酵素を分解し、したがってエキソソーム溶解後エキソソームmiRNAを分解する危険性を低下させるであろうプロテイナーゼK処理を含みます。マイクロRNA分析は高感度かつ特異的なリアルタイムPCR分析により行いました。 miR-1228-3pは、式2に記載の内在性コントロールとして使用し、データを正規化した– ΔΔCT。制御値は、ベースラインとして使用され、その結果は、対数スケールで示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この組み合わされたプロトコルを用いると、NSCLC患者の血漿からエキソソームmiRNA解析を行うことが可能でした。これらのデータは、疾患の状態を反映し得るが、これはさらなる研究により確認される必要があります。
この記事で使用されるプロトコルは、エキソソームを単離するための市販のキットに基づいていました。その理由は、限られた標準化につながる、より?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
