Exosomal микроРНК Анализ в немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) Плазменный Пациентов Через кПЦР: посильная Liquid Биопсия Tool
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
Низкий уровень выживаемости в НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого) больных, в основном , из – за ограниченной эффективности лечения в поздних стадиях заболевания и плохого раннего выявления 1. Активирующие мутации в гене EGFR, которые были обнаружены в субпопуляции пациентов с немелкоклеточным раком легких, как известно, придают чувствительность к ингибиторы тирозин – киназы (ИТК). К сожалению, большинство из EGFR , мутировавших пациентов с немелкоклеточным раком легких развивается устойчивость Tki 2. Особенно в этом контексте, правильный диагноз является обязательным. В общем случае, из-за локализации опухолей, получение тканей при биопсии НМРЛ не всегда осуществимо. Таким образом, некоторые исследования продолжаются, которые используют неинвазивные методы для получения этих биологических данных. Экзосомы описаны как жидкие биопсии компонентов , которые могут быть исследованы с целью получения диагностических и прогностических значений с неинвазивными методами 3.
Экзосомы являются nanovesicles (40 – 100 нм в диаметре) из еndocytic происхождения , которые выпускаются различными типами клеток , как в физиологических и патологических состояниях 4. Они могут нести белки, липиды, мРНК и микроРНК. Кроме того, некоторые исследования предполагают плейотропным роль опухолей происходит экзосомы, которые могут влиять на рост и выживаемость опухолевых клеток, ангиогенеза, стромальных и внеклеточного матрикса ремоделирования и лекарственной устойчивости 5.
MicroRNAs (микроРНК) короткие некодирующие РНК, которые участвуют в пост-транскрипционной регуляции, связывание 3'-UTR из мРНК мишеней и ведет к деградации мРНК или не-перевод 6. Сортировкой микроРНК в экзосомы было описано. В связи с этим, в последнее время было показано, в пробирке и в естественных условиях, селективной упаковки MIR-21 (известный микроРНК с онкогенных эффектов) в экзосомы высвобождаемых хронического миелолейкоза клеточных линий после того, как куркумин лечения 7.
exosomal микроРНК профиль похож на профиль микроРНК первичной опухоли , и эта функция может быть использована в ранней диагностике и прогнозировании 3. В частности, есть возможность охарактеризовать, с помощью ПЦР в реальном времени, выбранные микроРНК коррелировали с молекулярным профилем заболевания, например., EGFR мутации среди других 8.
Здесь анализ выбранной панели НМРЛ-коррелировала микроРНК 8-9 описано , что были выделены из экзосомы выпущенных в крови больных НМРЛ. После получения отчета сообщить согласие от пациентов, плазмы 12 пациентов с немелкоклеточным раком легких и 6 здоровых, были проанализированы. Изоляция экзосом была выполнена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Перед изоляцией экзосома образцы плазмы обрабатывали РНКазой, для того, чтобы разлагать загрязняющие циркулирующих микроРНК. Мы решили провести такой анализ с коммерческого набора из-за ограниченной стандартизации другой техниQues (например., ультрацентрифугирования), что особенно важно при работе с клиническими образцами. Этот набор включает в себя лечение протеиназы К, который будет ухудшать РНКазы, и, таким образом, уменьшает риск деградировать exosomal микроРНК после экзосома лизиса. Анализ микроРНК проводили высокой чувствительностью и специфичностью в режиме реального времени ПЦР-анализа; Mir-1228-3p был использован в качестве эндогенного контроля и данные были нормализованы в соответствии с формулой 2 – ΔΔct. Контрольные значения используются в качестве базовой линии, и результаты приведены в логарифмической шкале.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью этого комбинированного протокола можно было выполнить анализ exosomal микроРНК из плазмы пациентов с немелкоклеточным раком легких. Эти данные могут отражать состояние заболевания, но это должно быть подтверждено дальнейшего изучения.
Протокол, используемый в д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
