Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
Il basso tasso di sopravvivenza nel NSCLC (non a piccole cellule cancro ai polmoni) pazienti è dovuta principalmente alla limitata efficacia dei trattamenti di malattia avanzata e poveri diagnosi precoce 1. Mutazioni attivanti nel gene EGFR, che sono stati scoperti in una sottopopolazione di pazienti con NSCLC, sono noti per conferire sensibilità agli inibitori della tirosin-chinasi (TKI). Purtroppo, la maggior parte dei pazienti con NSCLC EGFR mutanti sviluppare una resistenza TKI 2. Soprattutto in questo contesto, una diagnosi corretta è obbligatoria. In generale, a causa della localizzazione dei tumori, l'ottenimento di tessuto bioptico nel NSCLC non è sempre possibile. Pertanto, diversi studi sono in corso che utilizzano metodi non invasivi per ottenere questi dati biologici. Exosomes sono descritti come componenti biopsia liquidi che potrebbero essere studiati in modo da ottenere valori diagnostici e prognostici con tecniche non invasive 3.
Esosomi sono nanovesicles (40 – 100 nm di diametro) di eorigine ndocytic che vengono rilasciati da diversi tipi di cellule, sia in condizioni fisiologiche e patologiche 4. Possono trasportare proteine, lipidi, mRNA e microRNA. Inoltre, diversi studi suggeriscono un ruolo pleiotropico di tumore derivato esosomi, che possono influenzare la crescita e la sopravvivenza delle cellule tumorali, l'angiogenesi, stromale e rimodellamento della matrice extracellulare e la resistenza ai farmaci 5.
I microRNA (miRNA) sono di breve RNA non codificanti che sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale, vincolante il 3'-UTR dei mRNA bersaglio e che porta l'mRNA di degrado o di un non-traduzione 6. Raccolta differenziata dei miRNA in esosomi è stato descritto. In questo contesto, recentemente è stato dimostrato, in vitro e in vivo, un imballaggio selettiva di miR-21 (un miRNA noto con effetti oncogeni) in esosomi rilasciati da linee cellulari leucemia mieloide cronica dopo il trattamento curcumina 7.
Ilprofilo exosomal miRNA è simile al profilo miRNA del tumore primario e questa caratteristica può essere sfruttata nella diagnosi precoce e la prognosi 3. In particolare, vi è la possibilità di caratterizzare, mediante real-time PCR, miRNA selezionati correlate con il profilo molecolare della malattia, per esempio., Mutazioni EGFR tra gli altri 8.
Qui, l'analisi di un panel selezionato di NSCLC-correlato miRNA 8-9 è descritto che sono stati isolati da exosomes liberati nel sangue di pazienti con NSCLC. Dopo aver ottenuto il consenso informare rapporto dai pazienti, al plasma di 12 pazienti con NSCLC e 6 controlli sani, sono stati analizzati. L'isolamento exosome è stata eseguita con kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Prima isolamento exosome, campioni di plasma sono stati trattati con RNAsi, per degradare contaminanti circolanti miRNA. Abbiamo deciso di effettuare questa analisi con un kit commerciale a causa della standardizzazione limitato di altri Techniques (ad es., ultracentrifugazione) che è particolarmente importante quando si lavora con campioni clinici. Questo kit comprende un trattamento proteinasi K, che degradano la RNAsi, e diminuisce il rischio di degradare miRNA exosomal dopo exosome lisi. analisi microRNA è stata effettuata da Real Time-analisi sensibile e specifica PCR; mir-1228-3p è stato utilizzato come controllo endogeno ed i dati sono stati normalizzati in base alla formula 2 – ΔΔct. I valori di controllo sono utilizzati come riferimento e risultati sono riportati in scala logaritmica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con questo protocollo combinato è stato possibile eseguire un'analisi exosomal miRNA dal plasma di pazienti con NSCLC. Questi dati possono riflettere lo stato della malattia, ma questo deve essere confermato da ulteriori studi.
Il protocollo utilizzato in questo articolo è basato su un kit commerciale per l'isolamento exosome. La ragione è che le altre procedure di isolamento noto (ad es., La densità ultracentrifugazione gradiente) richiedono procedure più manuali, port…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
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