Exosomal Análise miRNA em não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) dos pacientes Plasma Através qPCR: Um Líquido Biópsia ferramenta viável

Summary

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

Abstract

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2^{–ΔΔct 13}. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Introduction

A baixa taxa de sobrevivência em NSCLC (cancro do pulmão de células não pequenas) pacientes é devido principalmente à eficácia limitada dos tratamentos na doença avançada e pobres detecção precoce ^1. Mutações de activação no gene de EGFR, que foram descobertos numa subpopulação de doentes com NSCLC, são conhecidos para conferir sensibilidade a tirosina cinase (TKI inibidores). Infelizmente, a maioria dos doentes com NSCLC EGFR mutantes desenvolver resistência TKI ^2. Especialmente neste contexto, um diagnóstico correcto é obrigatória. Em geral, devido a localização de tumores, a obtenção de tecidos de biopsia em NSCLC nem sempre é viável. Portanto, vários estudos estão em curso que usa métodos não invasivos para obter estes dados biológicos. Os exossomas são descritos como componentes de biópsia líquidos que poderiam ser investigados de modo a obter valores de diagnóstico e de prognóstico com técnicas não-invasivas ^3.

Exossomos são nanovesículas (40-100 nm de diâmetro) de Eorigem ndocytic que são liberadas por diferentes tipos de células, tanto em condições fisiológicas e patológicas ^4. Eles podem transportar proteínas, lipídios, mRNA e microRNAs. Além disso, diversos estudos sugerem um papel pleiotrópico de exossomas provenientes de tumores, que podem influenciar o crescimento e a sobrevivência de células de tumor, angiogénese, estromal e remodelação da matriz extracelular e a resistência aos medicamentos ^5.

MicroRNAs (miRNAs) são curtos ARN não codificante que estão envolvidos na regulação pós-transcricional, a ligação 3'-UTR dos ARNm alvo e que conduz o ARNm para a degradação ou a um não-tradução ^6. separação selectiva dos miRNAs em exossomos tem sido descrita. Neste contexto, foi recentemente demonstrado, in vitro e in vivo, um empacotamento selectivo de miR-21 (um miARN bem conhecido com os efeitos oncogénicos) em exossomas divulgados pela linhas de células de leucemia mielóide crónica, após o tratamento de curcumina ^7.

operfil exosomal miARN é semelhante ao perfil de miARN do tumor primário e esta característica pode ser explorada no diagnóstico precoce e prognóstico ^3. Especificamente, existe a possibilidade de caracterizar, por PCR em tempo real, miARNs seleccionados correlacionados com o perfil molecular da doença, por ex., Mutações de EGFR, entre outros ^8.

Aqui, a análise de um painel seleccionado de NSCLC-correlacionada miARNs ^8-9 é descrito que foram isolados a partir de exossomas libertados no sangue de doentes com NSCLC. Após a obtenção do consentimento relatório de informar os pacientes, o plasma de 12 pacientes com NSCLC e 6 controlos saudáveis, foram analisados. O isolamento exossomo foi realizada com o kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Antes de isolamento exossomo, as amostras de plasma foram tratadas com RNase, a fim de degradar contaminantes circulam miARNs. Decidimos realizar esta análise com um kit comercial, devido à padronização limitado de outra techniques (por ex., ultracentrifugação) que é especialmente importante quando se trabalha com amostras clínicas. Este kit inclui um tratamento de proteinase K, que irá degradar o RNAse, e, assim, diminui o risco de degradar miARNs exosomal após lise exossoma. análise MicroRNA foi realizada por Real Time-análise sensível e específico PCR; Mir-1228-3p foi usado como um controle endógeno e os dados foram normalizados de acordo com a fórmula 2 ^{– ΔΔct.} Os valores de controlo são utilizados como linha de base e os resultados são mostrados em escala logarítmica.

Protocol

1. exossomo Isolamento Nota: O isolamento de exossomas a partir de amostras de plasma, foi realizado com um kit comercial, de acordo com o protocolo do fabricante e por adição de tratamento com RNase: (todos estes passos têm de ser realizados com os equipamentos de protecção pessoal e o ambiente e seguindo o processo legal específica para a manipulação de amostras biológicas ). Tomar 1 ml de plasma de cada amostra, armazenados a -80 ° C, e colocá-lo em gelo. C…

Representative Results

Um total de 12 de plasma de doentes com NSCLC e 6 controlos saudáveis ​​foram processadas com um kit comercial para o isolamento de exossoma a partir do plasma. Cada amostra foi processada por meio de análise de Western Blot, a fim de avaliar a marcadores exosomal ALIX (96 kDa) e TSG101 (43 kDa). Um exemplo destes resultados é mostrado para as amostras 3 na Figura 1, indicando que o isolamento exossoma a partir de amostras de plasma é possível com este protocolo…

Discussion

Com este protocolo combinado era possível realizar uma análise de miARN exosomal a partir de plasma de doentes com NSCLC. Esses dados podem refletir o estado da doença, mas isso precisa ser confirmado por um estudo mais aprofundado.

O protocolo utilizado neste artigo foi baseado em um kit comercial para o isolamento de exossoma. A razão foi que os outros processos de isolamento conhecidos (por exemplo., A densidade de ultracentrifugação de gradiente) requerem procedimentos mai…

Materials

Total exosome isolation kit (from plasma)	Invitrogen	4484450	Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9)	Cell Signaling	2171S
TSG-101 Antibody (C-2)	SantaCruz Biotecnology	SC-7964
Anti-Mouse HRP 1ml	Cell Signaling	7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50	GE HealthCare	25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Life Technologies	4440043