La recolección selectiva de leucocitos marginando-hepáticas
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Los sinusoides hepáticos contienen numerosos subtipos de leucocitos de diversas actividades inmunes críticos para el organismo. Por ejemplo, las células marginando hepática (MH) asesinas naturales (NK), también conocidas como células de pozo, se caracterizan morfológicamente como linfocitos granulares grandes (LGLs) y funcionalmente como leucocitos con capacidad citotóxica espontánea, lo que permite hepática resistencia contra el establecimiento de sangre metástasis tumorales Borne. El objetivo del método presentado en este documento es para permitir la recolección selectiva de leucocitos MH, con el fin de estudiar esta población celular importante y única (y el compartimento inmune), y para dilucidar el impacto de diversas manipulaciones (por ejemplo, la activación inmune) en estas células específicas.
A pesar del fracaso de la inmunidad para eliminar un tumor primario en desarrollo, la evidencia en pacientes con cáncer y en modelos animales indican que el sistema inmune puede controlar las células tumorales, las micrometástasis, y la enfermedad residual throu circulantela inmunidad mediada por células GH (CMI). Sin embargo, existe una inconsistencia aparente entre estos en capacidades in vivo y en estudios in vitro en seres humanos y en animales, que demuestran que la mayoría de las células tumorales autólogas son resistentes a la citotoxicidad mediante la circulación o leucocitos esplénicos 1,2. Esta inconsistencia se puede atribuir, al menos en parte, a la existencia in vivo de una subpoblación de leucocitos distinto, a saber, los (sinusoides) leucocitos marginando-hepática y su subpoblación de células NK activadas, es decir, células de pozo 3. De hecho, datos no publicados de nuestro laboratorio indican que en las ratas F344 células tumorales singénicas (MADB106), que se encontró resistente a circulantes y esplénicas leucocitos, fueron lisadas por células NK MH-4. Así, las células tumorales que son supuestamente "NK-resistente" a los leucocitos circulantes pueden ser controlados por las células MH-NK. Digno de mención, en ratones la actividad mejorada de MH-NK es evidente sólo después in vivo inmuneestimulación (por ejemplo, mediante el uso de Poly I: C o CpG-C) 5.
Las células NK específicos del hígado (MH-NK) están situados dentro de la luz sinusoidales, la adhesión a las células endoteliales y células de Kupffer. Células MH-NK se caracterizan exclusivamente por gránulos densos esféricas y vesículas de varilla de núcleo 6, que contienen fosfatasa ácida como enzimas lisosomales y perforina y granzimas como sustancias bioactivas 7,8. En comparación con las células NK circulantes, las células MH-NK exhiben un mayor número y tamaño de los gránulos y vesículas 9-11. Bajo condiciones inflamatorias, se demostró que las células MH-NK a exhibir una mayor expresión de LFA-1 12, en comparación con las células NK circulantes. Esta expresión potenciada puede constituir un mecanismo por el cual las células MH-NK son más citotóxicos contra ciertas células tumorales que las células NK 13,14 circulante. nterestingly, después de la incubación in vitro con interleuquina (IL) -2, las células MH-NK se agrandan, ysu número y tamaño de los gránulos aumentan, todos los cuales son consistentes con una células pro fi l de killer activadas por linfoquinas (LAK) 15.
leucocitos MH activos no se pueden obtener exclusivamente a través de los métodos de cosecha de leucocitos hígado estándar, que se basan en la molienda y la degradación biológica de los tejidos. Nuestro enfoque de perfusión descrito en este documento tiene dos ventajas importantes en comparación con los enfoques estándar. En primer lugar, el enfoque de perfusión cosecha selectivamente leucocitos MH, la prevención de la contaminación por otros leucocitos de otros compartimentos del hígado. En segundo lugar, la técnica de perfusión mejor preserva la integridad, la actividad, y el medio fisiológico de los leucocitos MH, a diferencia del procesamiento de tejido se aproxima que dañan las células o alterar su morfología, y debido a daños en los tejidos, inducir la liberación de diversos factores que marcadamente modular inmune actividad.
El hígado es el principal órgano diana para la metástasis del cáncer dend para diversas infecciones 16. A medida que las células MH poseen características singulares que es importante estudiar esta población específica en diversas condiciones con respecto a estas patologías. Por ejemplo, es digno de destacar que la activación inmune sistémica por varios BRM (por ejemplo, poli I: C o C-CpG) se han demostrado para activar MH-leucocitos más de 5 leucocitos circulantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de perfusión hepática que aquí se presenta permite una recolección selectiva y el estudio de la población única de marginando leucocitos hepáticas. Células hepáticas NK, también llamadas células de pozo 3, constituyen una población de células NK distintivo que residen en los sinusoides hepáticos. Se encuentran en ratas, ratones y 17 en los seres humanos 18,19. En comparación con las células NK periféricas aisladas, células de pozo demostrado mayor citotoxicid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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