קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
הכבד sinusoids מכיל תת לויקוציטים רבים של פעילויות שונות חיסון קריטיות האורגניזם. לדוגמה, marginating הכבד (MH) הרג טבעיים (NK) תאים, הידוע גם בשם תאים בור, מאופיינים מורפולוגית לימפוציטים פרטנית גדול (LGLs) והן מבחינה תפקודית כמו לויקוציטים עם קיבולת ציטוטוקסיות ספונטנית, מה שמאפשר בכבד התנגדות נגד הקמת דם גרורות גידול מובל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של לויקוציטים MH, כדי ללמוד אוכלוסיית תאים חשוב וייחודי זה (תא החיסון), וכדי להבהיר את ההשפעה של מניפולציות שונות (הפעלה חיסונית למשל) על תאים ספציפיים אלה.
למרות הכישלון של חסינות לחסל גידול ראשוני בפיתוח, ראיות חולות סרטן במודלים של בעלי החיים עולות כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחל שיורית throuתא בתיווך GH חסין (CMI). עם זאת, קיימת אי התאמה לכאורה בין אלה יכולות vivo ו במבחנה בבני אדם ובחיות, שיש בהם כדי להעיד כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי או לויקוציטים הטחול 1,2. חוסר עקביות זה ניתן לייחס, לפחות חלקית, על קיומה in vivo של תת-אוכלוסייה לויקוציטים ברורה, כלומר בכבד marginating (sinusoids) לויקוציטים-אוכלוסייה שלהם של תאי NK מופעלים, כלומר תאים בורים 3. ואכן, נתונים שלא פורסמו מהמעבדה שלנו הראו כי אצל חולדות F344 תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו עמידים לויקוציטים במחזור הטחול, היו lysed ידי תאים MH-NK 4. לכן, תאים סרטניים, כי הם לכאורה "NK עמידים" כדי לויקוציטים במחזור עשוי להיות נשלט על ידי תאים MH-NK. ראויים לציון, בעכברים פעילות מוגברת של MH-NK ניכרת רק לאחר in vivo החיסוניתגירוי (למשל באמצעות שימוש לי פולי: C או CPG-C) 5.
כבד ספציפי תא NK (MH-נ"ח) ממוקם בתוך לומן סינוסי, דבקות לתאי אנדותל ותאי Kupffer. תאי MH-NK מאופיינים באופן בלעדי על ידי גרגרים צפופים כדורי שלפוחית cored מוט 6, אשר מכילים חומצת phosphatase אנזימים ליזוזומלית, ו perforin ו granzymes כחומרים ביו 7,8. לעומת תאי NK, תאי MH-NK מציגים מספר גבוה וגודל גרגירי שלפוחית 9-11. בתנאים דלקתיים, תאי MH-NK הוצגו להפגין ביטוי גבוה של LFA-1 12, לעומת תאי NK. ביטוי משופר זו עשויה להוות מנגנון שבאמצעותו תאי MH-NK הם יותר ציטוטוקסיות נגד תאים סרטניים מסוימים מאשר תאי NK 13,14. nterestingly, בא במבחנת דגירה עם interleukin (IL) -2, תאי MH-NK להיות מוגדלים,המספר והגודל של גרגרים שלהם להגדיל, שכולן עולים בקנה אחד עם רוצח פרו fi le של מופעל lymphokine (LAK) תאים 15.
לויקוציטים MH הפעילים לא ניתן להשיג אך ורק באמצעות שיטות קציר לויקוציטים כבד הרגילות, אשר מבוססות על שחיקה ושפלה ביולוגית של הרקמה. יש גישה זלוף שלנו המתוארים כאן שני יתרונות מרכזיים לעומת הגישות הסטנדרטיות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי היבול לויקוציטים MH, מניעת זיהום על ידי לויקוציטים אחרים מעמוד תאים כבדים אחרים. שנית, טכניקת זלוף הטובה יותר שומרת על השלמות, הפעילות, ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MH, בניגוד עיבוד רקמות גישות הפוגעים בתאים או לשנות המורפולוגיה שלהם, ובשל ניזק לרקמות, לגרום לשחרור של גורמים שונים כי ניכרו לווסת חיסונית פעילות.
הכבד הוא איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטןnd לזיהומים שונים 16. ככל שתאי MH להציג מאפיינים ייחודיים חשוב ללמוד האוכלוסייה הספציפית הזה בתנאים שונים ביחס לפתולוגיות אלה. לדוגמא, הוא ראוי לציין כי הפעלה מערכתית חיסון על ידי BRMs השונה (למשל פולי לי: C או CPG-C) הוכח להפעיל MH-לויקוציטים יותר במחזור לויקוציטים 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת זלוף הכבד המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של marginating לויקוציטים כבד. תאים כבדיה NK, המכונים גם בורים תאים 3, מהווים אוכלוסיית תא NK ייחודית מתגוררות sinusoids הכבד. הם נמצאים אצל חולדות, עכברים 17 ובבני אדם 18,19. לעומת תאים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
