Селективный Заготовка Marginating-печеночной Лейкоциты
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Синусоидов печени содержат многочисленные подтипы лейкоцитов различных иммунных деятельности исключительно важное значение для организма. Например, marginating печени (MH) естественные киллеры (NK) клетки, также известные как пит клеток, которые характеризуются морфологически, как крупные зернистые лимфоциты (LGLs) и функционально как лейкоциты со спонтанной цитотоксической способности, что позволяет печеночно-устойчивость к созданию крово- принесенные метастазы опухолей. Цель метода , изложенного в настоящем документе, для того, чтобы выборочное заготовкой MH лейкоцитах, в целях изучения этой важной и уникальной популяции клеток (и иммунную отделение), а также для выяснения влияния различных манипуляций (например , активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.
Несмотря на провал иммунитета, чтобы устранить развитие первичной опухоли, доказательства у онкологических больных и моделях на животных показывают, что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни throuГ.Х. клеточный иммунитет (CMI). Тем не менее, существует явная несогласованность между ними в возможностях естественных условиях и в пробирке исследования у человека и у животных, которые показывают , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности циркулирующими или селезеночных лейкоциты 1,2. Это несоответствие может быть приписано, по крайней мере частично, к существованию в естественных условиях отчетливой лейкоцитарной субпопуляции, а именно marginating-печеночный (синусоидов) лейкоцитами и их субпопуляций активированных NK – клеток, а именно 3 -х пит клеток. В самом деле, неопубликованные данные из нашей лаборатории показали , что у крыс F344 сингенных опухолевых клеток (MADB106), которые были найдены устойчивые к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, лизируют клетки МН-NK 4. Таким образом, опухолевые клетки, которые, как утверждается, "НК-устойчивые" к циркулирующим лейкоцитах можно регулировать с помощью клеток МН-NK. Обращает на себя внимание, у мышей повышенная активность MH-НК видно только после в естественных условиях иммуннойстимулирование (например , за счет использования поли I: C или CpG-С) 5.
Печень-специфический NK-клетки (MH-NK) расположены внутри синусоидальных просвет, придерживаясь эндотелиальных клеток и клеток Купфера. Клетки MH-NK характеризуется исключительно сферическими плотных гранул и стержневых Порошковая везикул 6, которые содержат кислой фосфатазы в качестве лизосомальных ферментов и перфорина и гранзимами в качестве биологически активных веществ 7,8. По сравнению с циркулирующими клетками NK, МН-NK – клетки обладают более высокой количество и размер гранул и везикул 9-11. При воспалительных процессах , клетки МН-НК было показано , что демонстрируют более высокую экспрессию LFA-1 12, по сравнению с циркулирующих НК – клеток. Это расширенное выражение может представлять собой механизм , с помощью которого устройство MH-NK – клетки более токсичным в отношении некоторых опухолевых клеток , чем циркулирующих NK клеток 13,14. nterestingly после инкубации в пробирке с интерлейкина (IL) -2, MH-NK – клетки увеличиваются, иих количество и размер гранул увеличивается, все из которых согласуются с профилем из лимфокинактивированных киллеров (ЛАКК) 15.
Активные лейкоциты MH не могут быть получены исключительно за счет стандартных методов уборки лейкоцитарных печени, которые основаны на измельчении и биологической деградации ткани. Наш подход перфузия описанный здесь имеет два основных преимущества по сравнению со стандартными подходами. Во-первых, перфузия подход селективно заготавливает MH лейкоциты, предотвращая загрязнение другими лейкоцитами из других отсеков печени. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность, активность и физиологической среде MH лейкоцитах, в отличие от обработки ткани приближается к повреждению клеток или изменению их морфологии, а также из-за повреждения тканей, вызывают высвобождение различных факторов, которые заметно модулировать иммунный Мероприятия.
Печень является основным органом-мишенью для метастазирования рака ай для различных инфекций 16. Как MH клетки обладают уникальными характеристиками, важно изучить эту конкретную группу населения в различных условиях в отношении этих патологий. Например, особо отметить , что системная активация иммунной системы с помощью различных BRMs (например , поли I: С или CpG-С) , как было показано , чтобы активировать MH-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитов 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод перфузии печени, представленные здесь позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции marginating печени лейкоциты. Печени NK – клетки, также называемые ямы клетки 3, составляют отличительную популяцию NK клеток , которые находятся в печеночных синусоидов. Они вст…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
