Introduction
간 사인 곡선은 유기체에 중요한 다양한 면역 활동의 많은 백혈구 아형이 포함되어 있습니다. 예를 들어,도 덩이 세포로 알려진 간을 marginating (MH), 자연 살해 (NK) 세포, 특징 형태학 큰 과립 림프구 (LG 생명 과학)와 기능적으로 혈액 - 확립에 대하여 간 저항을 가능 자연 세포 독성 용량 백혈구뿐만 매개 종양 전이. 본 명세서에있어서의 목표는 중요한 독특한 세포 집단 (면역 함)을 연구하기 위해 MH 백혈구 선택적 수확을 가능하게하고, 이러한 특정 세포에 대한 각종 조작의 영향 (예 : 면역 활성)을 규명하는 것이다.
현상 원발 종양을 제거하는 면역 장애에도 불구하고, 암 환자 및 동물 모델에서의 증거는 면역계가 종양 세포, 미세 전이 및 throu 잔여 질병을 순환 제어 할 것을 지시GH 세포 매개 면역 (CMI). 그러나, 생체 내 기능과 인간에서 시험 관내 연구에서 가장자가 종양 세포는 순환 또는 비장 백혈구 1,2- 의한 세포 독성에 내성이 있음을 입증 동물, 이들 사이에 명백한 불일치가있다. 이러한 불일치는 별개 백혈구 모집단, 즉 marginating - 간 (정현파) 백혈구 활성화 NK 세포, 즉 세포 덩이 3들의 모집단의 생체 내 존재에 적어도 부분적으로 기인 할 수있다. 사실, 우리의 실험실에서 출판되지 않은 데이터는 F344 쥐에서 동계 종양 세포 순환 및 비장 백혈구에 내성이 발견되었다 (MADB106가), MH-NK 세포 (4)에 의해 용해 된 것으로 나타났다. 따라서, 순환 백혈구에 의심 "NK 내성"이다 종양 세포 MH-NK 세포에 의해 제어 될 수있다. 주목할만한, 마우스에서 MH-NK의 개선 활동은 면역 생체 내에서 다음 분명하다(폴리 I의 사용을 통해 예 : C 또는의 CpG-C) 자극 (5).
간 특정 NK 세포 (NK-MH)은 내피 세포 및 쿠퍼 세포 부착, 정현파 루멘 내부에 위치하고있다. MH-NK 세포는 단독으로 생리 활성 물질로서 7,8- 리소좀 효소 및 퍼포 granzymes와 같은 산성 포스파타제를 포함하는 조밀 한 구형 입자 및 막대 코어 드 소체 (6)을 특징으로한다. NK 세포를 순환과 비교하여, MH-NK 세포 과립 및 소포 9-11 높은 수 및 크기를 나타낸다. NK 세포 순환에 비해 염증 조건 MH-NK 세포, LFA-1 (12)의 더 높은 발현을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 향상된 발현 MH-NK 세포는 NK 세포 13,14 순환 비해 특정 종양 세포에 대해 세포 독성 더있는 메커니즘을 구성 할 수도있다. nterestingly, 인터루킨 (IL) -2와 시험 관내 인큐베이션에 따라, MH-NK 세포가 확대되고,자신의 번호와 과립의 크기는 프로 Fi를 제작 림 포카 인 활성화 킬러의 (LAK) 세포 (15)와 일치 모두 증가.
액티브 MH 백혈구 독점적 그라인딩과 조직의 생물학적 분해에 기초하는 표준 간 백혈구 수확하는 방법을 통해 얻어 질 수 없다. 본원에 기술 된 우리 관류 방법은 표준 방법에 비해 두 가지 장점을 갖는다. 우선, 관류 방법은 선택적으로 다른 간 구획에서 다른 백혈구에 의한 오염을 방지 MH 백혈구를 수확. 조직 처리 손상 세포 것을 접근하거나 형태를 변경하고, 조직 손상으로 인해 현저 면역 조절 다양한 인자의 방출을 유도 달리 둘째, 더 관류 기술, 무결성, 활동, 및 MH 백혈구의 생리적 환경 보존 활동.
간은 암전 A에 대한 중요한 타겟 기관이다차 다양한 감염 16. MH 전지 고유 특성을 나타내는 바와 같이 이들 병변에 대해 다양한 조건에서이 특정 인구를 연구하는 것이 중요하다. 예를 들어, 다양한하는 BRM에 의한 전신 면역 활성화를주의하는 가치가있다 (예를 들면 폴리 I : C 또는의 CpG-C)가 백혈구 5 순환보다 MH-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다.
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Protocol
윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 텔 아비브 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 쥐 프로토콜
- 준비
- PBS 헤파린 (30 유닛 / ml) 용액을 준비 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 식염수 (PBS) 1X 버퍼 용액. 동물 당 35 ml의를 계산합니다.
- 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
- (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
- MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
- 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 이소 플루 란을 포함하는 50 ML 튜브를 배치그 흉강을 열 때까지 쥐의 머리 주위 -soaked 패드.
- 호흡 중단시 즉시 간 및 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다. 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
- 특히, 상부 가슴 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 리브를 향해 대각선 양쪽에 손상을 내장하지 않고 낮은 복부 정중선 점에서 절개, 진행을 시작합니다.
- 약 분 내 (~ 250 그램 동물에서 6 ml)에 가능한 한 많은 혈액을 수집 주사기로 우심실에서.
- 관류의 수집을 가능하게하는, 마음에 가능한 한 가까운 지혈과 꼬리 대정맥을 클램프.
- 포털 정맥을 노출, 실험자의 오른쪽에있는 동물 외부 장과 장소를 잡아 당깁니다.
- 가능한 꼬리 같이 문맥으로 연동 펌프 (25)에 연결된 G IV 카테터, 삽입하지만 비장 정맥에 주동이.
- 지혈에 꼬리 대정맥에 5 ML의 주사기에 연결된 25 G 나비 바늘을,,, 삽입합니다.
- 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 주사기로 혈액으로 오염 관류의 첫 번째 ml의를 수집합니다. 관류 색이 교대로 (약 3 ~ 5 ㎖) 붉은 창백한 때까지 계속합니다. 간장의 색이 밝은 갈색으로 변화하고 있음을 알 수 있습니다.
- 연동 펌프를 정지하지 않고, 20 ml의 수확 주사기와 5 ml의 수확 주사기 교체 관류 고속화 (최대 4 ml / 분)을 이용 간 관류 적어도 20ml를 수집. 연속적으로 포집 주사기 내로 관류 흐름을 모니터링하고, (대정맥 벽 붕괴 통해 바늘을 방해 할 수있는) 너무 강한 진공을 피한다.
- 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
- 백혈구 추출
- 뜨는을 기음
- 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 뜨는을 대기음. 학습 목표에 기초하여, 그대로 조제를 사용하여, 또는 추가적인 정제를 (예를 들면, 밀도 구배 분리)을 수행.
- 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류 액 4 mL로. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
- 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.
2. 마우스 프로토콜
- 준비
- 인산 1 ㎖ 당 방부제없는 헤파린 30 단위 첨가하여 실온 (RT)에서 사용되는 헤파린 PBS (30 단위 / ml) 용액을 준비 식염수 (PBS) 1X solutio 완충엔. 동물 당 20 ㎖를 계산합니다.
- 기포를 제거하는 연동 펌프 라인과 나비 바늘을 통해 헤파린 PBS를 통과한다.
- (중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브) 가위 2 쌍, 무딘 칼날 집게, 2 지혈제 및 치아 조직 포셉 - 수술 도구를 소독.
- MH-백혈구의 간 및 컬렉션의 관류
- 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 예방 조치로서, 그 흉강을 열 때까지 마우스의 머리 주위에 이소 플루 란 젖은 패드를 포함하는 15 ML 튜브를 놓습니다.
- 침대에 마우스의 사지를 고정합니다.
- 그대로 다이아 프램의 하부 측면을 유지, 간 및 호흡 중단시 즉시 심폐 복잡한을 노출 복막와 가슴 충치를 엽니 다 (A 배수 흉강 풀을 만들 수 있습니다). 이 과정을 통해 출혈하지 마십시오.
- 특히, 아래에 절개를 시작합니다가슴 위쪽 캐비티 수준으로 그들을 통해 절단 대각선으로 갈비뼈를 향해 양쪽에 복부 정중선 손상 내부 장기가없는 점, 진행,.
- 간문맥 노출되도록, 실험자의 오른쪽 바깥 동물 장내 장소를 철수.
- 지라 정맥에 포털 정맥 주동이에 연동 펌프에 연결된 30g 바늘을 삽입합니다.
- 흉강에서 관류의 배수 및 수집 할 수 있도록 다이어프램 위의 하대 정맥을 잘라.
- 약 3 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 흉강 풀에서 혈액으로 오염 관류의 제 3 ㎖를 수집합니다.
- 이 관류를 폐기하십시오. 필요한 경우 생리 식염수를 사용하여 다시 같은 세척을 반복 한 경우에만 다음 간 관류를 수집하기 시작합니다.
- 다시 개시까지 ㎖ / 분 (4)의 속도로 관류 및 사용 흉강에서 관류 액 10 ㎖를 수집주사기에 연결된 나비입니다.
- 간장의 색이 밝은 갈색으로 변합니다 때 관류을 종료합니다.
- 백혈구 추출
- 원심 분리기 (400)의 X g에서 10 분 동안 관류.
- 뜨는을 대기음.
- 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS, 원심 분리기를 추가하고 학습 목표를 바탕으로 뜨는을 대기음, 그대로 준비를 사용하거나 추가 정제를 (예를 들어, 밀도 구배 분리)를 실시하고 있습니다.
- 구체적으로, 층 50 CC 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 밀도 구배 분리 질량 4㎖를 통해 관류마다 4 용액. 휴식을 끄고 30 분 동안 754 XG, 실온에서 튜브를 스핀.
- 수동 피펫으로 밀도 구배 분리 - 상층 액 계면에서의 단핵 층을 구하는 PBS로 세척하고, 5 ML 튜브에 삽입합니다.
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Representative Results
F344 래트에서 우리는 간 조직의 기계적 분쇄 다음, 전체 간 세포 집단의 세포 독성 (강제 간 관류 간 정현파 수집) MH-NK 세포의 세포 독성을 비교 및 순환 백혈구의 세포 독성에 관한 것이다. 전체 세포 제제는 면역 분석법의 루틴으로 적어도 3 회 세척하고, 목표 세포주로서, 우리는 동종 YAC-1 또는 동계 MADB106 표적 세포주를 사용 하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 4 -, MH-NK 세포는 전체 간세포 집단 (도 1) 모두를 MADB106 및 YAC-1을 표적 세포주 대 (~ 80 % 각각 100 %까지) 심각한 독성을 나타내 반면 순환 백혈구 (도 2 및 3)의 깊이보다 낮은 세포 독성 수준과 동계 MADB106 목표 세포주에 대해 거의 사멸을 표시. 같은 relati기계적으로 처리 간은 또한 세척 및 밀도 구배 분리 (그림 4), 문학의 일반적인 수준을 시행 할 때 세포 독성의 낮은 수준은 분명했다했습니다. 따라서, MH-NK 세포 F344 쥐의 세포 독성 고유하게 높은 수준을 나타낸다. FACS 분석을 실시하고 다음 세포 개체군의 구성에 깊은 차이가 밝혀졌다 : 단핵 세포 (CD161dim), NK 세포 (CD161 밝은), T 세포 (CD3), B 세포 (CD45)를하고, NKT (CD161 및 CD3) 세포. 성숙 프로파일 (CD11b를 / CD27)의 주요 차이는 (그림 5) 다른 구획 사이에 분명했다.
그림 1 :. MH-구획 throu에서 수확 전체 간 세포 인구의 세포 독성 (YAC-1 대상 세포주) MH-NK 세포 (에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교,간에서의 기계적 처리에 의해 수확 된 전체 간암 세포 집단은 최소 수준 (p <0.05)를 표시하면서 YAC-1을 목표 세포주에 대해 심각한 상해 활성을 나타내었다)를 본원에 기재된 방법을 GH. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 백혈구 (YAC-1 대상 세포주를) 순환의 세포 독성에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교. 순환 백혈구 세포 독성의 최소 레벨을 표시하는 동안 (본원에 기재된 방법을 통해 MH 구획에서 수확) MH-NK 세포는 YAC-1을 목표 세포주에 대한 세포 독성을 나타내 깊은(P <0.05). X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 :. (본원에 기재된 방법을 통해 MH 구획에서 수확) 백혈구 (MADB106 표적 세포 라인) MH-NK 세포 순환 세포 독성 MH-NK 세포의 세포 독성을 비교는 동계 MADB106 대해 심각한 독성을 나타내 순환 백혈구 세포 독성 (p <0.05)의 최소 레벨을 표시하면서 세포주를 대상. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. 여기를 클릭하십시오 t오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4 :. MH-에서 수확 밀도 구배 분리 (YAC-1 대상 셀 라인) MH-NK 세포 (를 통해 세척 및 농축 된 전체 간 림프구의 세포 독성에 MH-NK 세포의 세포 독성의 비교, 세정) 밀도 구배 분리를 통해 농축 하였다 기계 가공, 다음 전체 간 림프구 (까지 (세포 독성이 현저하게 낮은 수준을 표시하는 동안 본 명세서에 설명 된 방법을 통해 구획)는 YAC-1을 목표 세포주에 대해 심각한 독성을 나타내 30 %) (p <0.05) 문헌에서 전형적인 그. X 축은 이펙터 대 표적 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. 하시기 바랍니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 :. 단핵구 (CD161dim), NK 세포 : 순환 단핵 상기 MH-단핵구, 전체 간 단핵 세포로부터 단핵구 서브 세트와 NK 세포 서브 세트의 비교는 FACS 분석은 다음 세포 개체군의 조성 분명한 차이를 보여준다 (CD161 밝은), T 세포 (CD3), B 세포 (CD45), 및 NKT (CD161 및 CD3) 세포뿐만 아니라 다른 구획 사이의 성숙 프로파일 (CD11b를 / CD27)의 차이. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
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Discussion
본 명세서 간 관류 방법은 선택적 수확 할 수 있으며 간 백혈구 marginating의 고유 인구 공부. 또한 피트 셀 3이라고 간 NK 세포, 간장 정현파에있는 독특한 NK 세포군을 구성한다. 그들은 쥐, 마우스 (17)과 인간 (18, 19)에서 발견된다. 절연 주변 NK 세포에 비해 피트 셀 작은 세포질 과립 (20)의 더 많은 수, 및 LFA-1 (12) 표면 항원의 이상 발현이 나타났다, YAC-1 및 CC531s 표적 세포 라인 (20)에 대하여 높은 세포 독성을 증명 . 또한, 절연 혈액 NK 세포와 달리 세포 덩이 NK 내성 P815 세포를 용균 할 수있다. 랫트와 유사 구덩이 세포, 인간 간 NK 세포는 NK 세포 18,19 순환 비교하여 NK-K562 민감한 표적 세포에 대해 높은 독성을 가지고, 강한 NK를 Lyse 표적 세포 18에 도시 하였다. Overal간 구체적 고유 다양한 질병에 관여하는 바와 같이 L이 면역이 장기 내에 조사되어야하고, MH 구획의 실질 세포, 쿠퍼 및 성상 세포와 구별되어야한다.
소개에 자세히 설명 된 바와 같이, 우리의 관류 방법은 선택적으로 수확 MH 백혈구의 일반적인 기계적 연마 / 생물학적 분해 과정을 통해 유리하다, 더 나은의 무결성, 활동 및 MH 백혈구의 생리적 환경을 보존. 사실, NK 세포 독성을 평가, 우리의 접근 방식을 통해 수확 MH 백혈구는 NK 세포의 비슷한 숫자에도 불구하고, 기계적 연마 과정을 통해 수확 백혈구보다 현저하게 높은 NK 세포 독성을 나타내었다.
간장 관류 기술은 동물 연구 만 동작 가능하다. 생물학적 의문을 제기 할 수있다 면역 구획 사이 그러나이 방법에서 얻은 특정 통찰력이 표시에 대해 언급 차이알 단독 백혈구 순환에 따라 관찰의 임상 적 의의. 다른 면역 구획에 면역 지수를 측정 동물 연구는 순환의 각 면역 지수가 반영 또는 MH 실에서의 수준과 상관되는 정도를 제안 할 수 있습니다. 흥미있는 관측은 관류 MH-NK 세포 만 동물 (21)의 연역적 면역 자극 다음 표적 세포에 대하여 현저한 세포 독성 활성을 입증한다 마우스에서이 기술을 채용을 말한다.
기술의 몇 가지 중요한 측면을 표시해야합니다. 모두 쥐와 생쥐에서 흉강은 호흡의 완전한 정지 다음 널리 즉시 열, 최소한의 출혈되어야한다. 쥐에서, 심장 혈액의 최대 양이 관류 전에 철회하는 것이 좋습니다. 그것은 문맥에서 혈압을 감소하고 쥐에서, 심장으로부터 채혈을 권장되지이 과정을 계속 통해 어렵게 바늘을 삽입 할 수 있습니다. 하나의 바늘이 안정된 위치에 대한 간으로 문맥의 입구에 삽입으로부터의 거리가 충분하다는 것을 보장하기를 원하는 모든 허용으로이 니들 삽입, 비장의 정맥에 인접하지만 입쪽 이루어져야 로브는 관류하세요. 표면에 평행하므로 혈관 벽 파열의 위험이 최소화되는 동안 바늘은 문맥에 삽입되어야한다. 관류 수집 용 꼬리 대정맥에 바늘을 삽입하는 동안 래트에서, 관류의 전위 누출을 피하기 위해 가능한 한 좁은 입구 포인트를 유지하는 것이 중요하다. 마우스에서, 불필요한 혈액 오염을 방지하기 위해, 다른 혈관이나 폐 파열없이 흉강 내부 대정맥 잘라 조숙하게하는 것이 중요하다. 연동 펌프를 사용하는 주요 장점은 내부 및 사이 관류 속도 위에 안정적이고 통제동물. 문맥의 파열을 방지하기 위해, 전체 과정 동안에 낮은 유속을 유지하는 것이 중요하다. 간 관류 첫 밀리리터가 혈액으로 오염 된 바와 같이, 그들이 폐기되어야한다. 동물 사이의 표준화를 달성하기 위해, MH의 관류 수집을 시작하는 기준은 밝은 갈색 (아닌 특정 볼륨의 컬렉션)에 어두운 갈색의 색상 전환을 기반으로합니다.
절차를 수행 함께 여러 오작동이 발생할 수 있지만, 대부분은 되돌릴 수 있습니다. PBS를이 간으로 수혈되는을 통해 바늘이 밖으로 미끄러 져의 경우는 약간 더 주동이의 위치에 바늘을 재 삽입 (더 나은 가시성을 달성하기 위해), 연동 펌프를 중지 창자의 주변 지역을 흡수하는 것이 좋습니다, 펌프를 다시 시작합니다.
본원에 기재된 간 관류 방법은 비교적 간단한 공정에 MH 백혈구 집단의 선택을 수확 할 수있다. 주어진이 인구는 고유 한 특징이 다른 면역 구획에서 백혈구와 비교하고, 유기체의 생물학적 및 임상 적 의의를 가질 수있다 표시됩니다 다른 구획에서 백혈구가 MH 인구의 프로파일을 반영하지 않을 수 있으므로 가능한 경우, 우리는이 방법의 사용을 권장합니다. 이 기술은 인간 행할 아니므로 또한, 우리는 또한 특히 간 관련 프로세스 및 질병을 공부 MH 특성과 상관 관계 특정 순환 바이오 마커를 명확히하기 위해 동물을 사용하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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