Selektiv Skörd av Marginating-lever leukocyter
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Levern sinusvågor innehåller många leukocyter subtyper av olika immun aktiviteter kritiska till organismen. Till exempel marginating lever (MH) naturliga mördarceller (NK), även känd som pit celler, som kännetecknas morfologiskt som stora granulära lymfocyter (LGLs) och funktionellt som leukocyter med spontan cytotoxisk kapacitet, vilket gör att levern-motstånd mot inrättandet av blod- burna tumörmetastaser. Målet med den metod som presenteras här är att möjliggöra selektiv skörd av MH leukocyter, för att studera denna viktiga och unika cellpopulation (och immun fack), och att belysa effekterna av olika manipulationer (t.ex. immunaktivering) på dessa specifika celler.
Trots misslyckandet av immunitet för att eliminera ett utvecklingsprimärtumör, bevis hos cancerpatienter och djurmodeller tyder på att immunsystemet kan styra cirkulerande tumörceller, mikrometastaser och kvarvarande sjukdom through cellmedierad immunitet (CMI). Det finns dock en uppenbar inkonsekvens mellan dessa in vivo-kapacitet och in vitro studier på människor och djur, som visar att de flesta autologa tumörceller är resistenta mot cytotoxicitet genom cirkulerande eller mjälten leukocyter 1,2. Denna inkonsekvens kan tillskrivas, åtminstone delvis, på att det finns en distinkt leukocyt subpopulation, nämligen marginating-hepatiska (sinuskurvor) leukocyter och deras subpopulation av aktiverade NK-celler, nämligen grop cellerna 3 in vivo. I själva verket, opublicerade data från vårt laboratorium indikerade att i F344 råttor syngena tumörceller (MADB106), som befanns resistent mot cirkulerande och mjälten leukocyter, lyserades av MH-NK-celler 4. Således kan tumörceller som påstås "NK-resistent" till cirkulerande leukocyter styras av MH-NK-celler. Anmärkningsvärt i möss ökad aktivitet av MH-NK är uppenbar först efter in vivo immunstimulering (t.ex. genom användning av Poly I: C eller CpG-C) 5.
Lever-specifika NK-celler (MH-NK) är belägna i sinus lumen, som ansluter sig till endotelcellerna och Kupffer celler. MH-NK-celler uteslutande kännetecknas av sfäriska täta granuler och stav fyllda vesiklar 6, som innehåller syrafosfatas som lysosomala enzymer och perforin och granzymes som bioaktiva ämnen 7,8. Jämfört med cirkulerande NK-celler, MH-NK-celler uppvisar en högre antalet och storleken på granuler och vesiklar 9-11. Under inflammatoriska tillstånd, var MH-NK-celler visat sig uppvisa högre uttryck av LFA-1 12, jämfört med cirkulerande NK-celler. Denna förbättrade uttryck kan utgöra en mekanism genom vilken MH-NK-celler är mer cytotoxiska mot vissa tumörceller än cirkulerande NK-celler 13,14. nterestingly, följande in vitro-inkubation med interleukin (IL) -2, MH-NK-celler blir förstorad, ochderas antal och storlek av granulat ökar, som alla är förenliga med en pro fi le av lymfokin-aktiverade mördarceller (LAK) -celler 15.
Aktiva MH leukocyter kan inte enbart erhållas genom de vanliga lever leukocyter skördemetoder, som är baserade på slipning och biologisk nedbrytning av vävnaden. Vår perfusion metod som beskrivs här har två stora fördelar jämfört med vanliga metoder. För det första perfusion metod skördar selektivt MH leukocyter, förhindra förorening av andra leukocyter från andra lever fack. För det andra perfusion teknik bättre bevarar integritet, aktiviteten och den fysiologiska miljön i MH leukocyter, till skillnad från vävnadsbearbetning närmar som skadar celler eller ändra sin morfologi, och på grund av vävnadsskada, inducera frisättningen av olika faktorer som påtagligt modulera immun aktivitet.
Levern är ett viktigt målorgan för cancermetastas ennd för olika infektioner 16. Som MH celler uppvisar unika egenskaper är det viktigt att studera denna specifika befolkningen under olika förhållanden med avseende på dessa sjukdomar. Till exempel, är det värt att notera att systemisk immunaktivering av olika BRMs (t.ex. poly-I: C eller CpG-C) har visats aktivera MH-leukocyter mer än cirkulerande leukocyter 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden leverperfusion presenteras häri möjliggör en selektiv avverkning och studera den unika befolkningen marginating lever leukocyter. Lever NK-celler, även kallade grop celler 3, utgör en distinkt NK cellpopulation som bor i leversinusvågor. De finns i råttor, möss 17 och hos människor 18,19. Jämfört med isolerade perifera NK-celler, grop celler uppvisade högre cytotoxicitet mot YAC-1 och CC531s mål cellinjer 20, visade sig ha ett större antal mindre cytoplas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
