Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Les sinusoïdes hépatiques contiennent de nombreux sous-types de leucocytes de diverses activités immunitaires importantes pour l'organisme. Par exemple, marginating hépatique (MH) tueuses naturelles (cellules NK), aussi appelées cellules de la fosse, se caractérisent morphologiquement comme grands lymphocytes granuleux (LGL) et fonctionnellement comme leucocytes avec une capacité cytotoxique spontanée, permettant hépatique résistance contre l'établissement de encéphalique métastases tumorales supportés. L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective des leucocytes MH, afin d'étudier cette population cellulaire importante et unique (et le compartiment immunitaire), et d'élucider l'impact des diverses manipulations (par exemple l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.
En dépit de l'absence d'immunité pour éliminer une tumeur primaire en développement, la preuve chez les patients cancéreux et les modèles animaux indiquent que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles Throul'immunité à médiation cellulaire gh (CMI). Cependant, il y a une contradiction apparente entre ces capacités dans vivo et des études in vitro chez l' homme et chez les animaux, qui démontrent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par circulation ou leucocytes spléniques 1,2. Cette incohérence peut être attribuée, au moins en partie, à l'existence in vivo d'une sous – population leucocytaire distincte, à savoir les (sinusoïdes) leucocytes marginating-hépatique et leur sous – population de cellules NK activées, à savoir les cellules de la fosse 3. En effet, les données non publiées provenant de notre laboratoire ont indiqué que des rats F344 cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélées résistantes aux leucocytes circulants et spléniques, ont été lysées par les cellules MH-NK 4. Ainsi, les cellules tumorales qui sont prétendument "NK-résistant" aux leucocytes circulants peuvent être contrôlées par les cellules MH-NK. Il convient de noter, chez la souris l'activité accrue de MH-NK est évident qu'à la suite in vivo immunitairela stimulation (par exemple , par l'utilisation de poly I: C , ou le CpG-C) 5.
Les cellules NK spécifiques hépatiques (MH-NK) sont situés à l'intérieur de la lumière sinusoïdales, adhérant aux cellules endothéliales et les cellules de Kupffer. Cellules MH-NK sont caractérisées exclusivement par des granules denses sphériques et des vésicules de tige-évidée 6, qui contiennent de la phosphatase acide que les enzymes lysosomales et perforine et granzymes comme substances bioactives 7,8. Par rapport à circulation des cellules NK, les cellules MH-NK présentent un plus grand nombre et la taille des granules et des vésicules 9-11. Dans des conditions inflammatoires, des cellules MH-NK ont été révélés présenter une expression plus élevée de LFA-1 12 par rapport à la circulation des cellules NK. Cette expression accrue peut constituer un mécanisme par lequel les cellules MH-NK sont plus cytotoxiques contre certaines cellules tumorales circulantes que les cellules NK 13,14. nterestingly, après une incubation in vitro avec l' interleukine (IL) -2, les cellules MH-NK se dilatent etleur nombre et la taille des granules augmentent, qui sont tous compatibles avec un pro fi le du tueur de lymphokine activé (LAK) cellules 15.
leucocytes actifs MH ne peuvent pas être exclusivement obtenues par les méthodes de récolte leucocytaires du foie standard, qui sont basées sur le broyage et la dégradation biologique du tissu. Notre approche de perfusion décrit ici présente deux avantages majeurs par rapport aux approches standard. Premièrement, l'approche de perfusion récolte sélective des leucocytes MH, empêchant la contamination par d'autres leucocytes d'autres compartiments du foie. Deuxièmement, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité, l'activité, et le milieu physiologique des leucocytes MH, contrairement au traitement des tissus approches qui endommagent les cellules ou modifier leur morphologie, et en raison de lésions tissulaires, induisent la libération de divers facteurs qui modulent nettement immunitaire activité.
Le foie est un organe cible majeur pour les métastases du cancer and pour diverses infections 16. Comme les cellules MH présentent des caractéristiques uniques, il est important d'étudier cette population spécifique dans diverses conditions à l'égard de ces pathologies. Par exemple, il est intéressant de noter que l' activation immunitaire systémique par divers BRM (par exemple poly I: C ou CpG-C) ont été montré pour activer MH-leucocytes plus de leucocytes 5 circulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de perfusion du foie présenté ici permet une récolte sélective et à l'étude de la population unique de marginating leucocytes hépatiques. Cellules NK hépatiques, également appelées cellules fosse 3, constituent une population de cellules NK distinctif qui résident dans les sinusoïdes hépatiques. On les trouve chez les rats, les souris 17 et chez les humains 18,19. Par rapport aux cellules périphériques isolées NK, des cellules de puits montré une cytotoxi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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