Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l'utilizzo di miRNA<em> In Situ</em> ibridazione
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Il cancro al seno è uno dei tumori più comuni che colpiscono la popolazione femminile in tutto il mondo. Oltre 1,3 milioni di casi di cancro al seno sono segnalati ogni anno in tutto il mondo 1,2. Anche se le cellule tumorali sono stati tradizionalmente considerati come biologicamente omogenea e altamente proliferative, è diventato evidente che il cancro al seno è geneticamente e clinicamente eterogenea. La resistenza ai farmaci antitumorali prevalenti è una caratteristica dei tumori al seno avanzato, che porta alla mortalità nella maggior parte dei pazienti attraverso la sua facilitazione della progressione del cancro e le metastasi a distanza 3.
I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di RNA lunghi circa 22 nucleotidi che regolano l'espressione genica bloccando traduzione dell'mRNA o mediare mRNA degrado 4. Più di 2.000 differenti miRNA sono stati finora identificati nell'uomo, che sono collegati a malattie umane 5. Una crescente serie di studi have ha dimostrato che miRNA possono funzionare come oncogeni e soppressori tumorali e sono spesso disregolazione nei tumori 6. miRNA impatto fortemente tutta la tumorigenesi primaria controllando i principali regolatori del ciclo cellulare, la senescenza, l'apoptosi e autofagia, insieme a quelli della motilità delle cellule tumorali, invasione e metastasi 7.
Espressione aberrante miRNA è stata anche associata con implicazioni cliniche, come fase, la differenziazione, la prognosi e la risposta alla terapia adiuvante 8. In particolare, l'aumento di espressione di miR-146 è correlato con una scarsa prognosi nei pazienti affetti da cancro del polmone 9. Un altro studio ha dimostrato che l'espressione perduto di miRNA-let7b è legata a fenotipi maligni e, di conseguenza, scarsa sopravvivenza 6. Capire i tipi di cellule e strutture che esprimono miRNA è una parte importante di comprensione dei meccanismi attraverso i quali alterazioni delle cellule miRNA espressione e influenzatessuto fenotipi 10. Alcuni miRNA trovati ad essere secreto nelle cellule stromali sono prese in dalle cellule epiteliali e in particolare agiscono sui loro obiettivi. Allo stesso modo, miR-212 e miR-132 sono secreti dalle stroma e regolano le interazioni epiteliali-stromale necessari per l'escrescenza duttale durante lo sviluppo della ghiandola mammaria 11. L'obiettivo generale di questo articolo è quello di spiegare un protocollo dettagliato per rilevare miRNA nei tessuti di cancro al seno attraverso miRNA ibridazione in situ. Abbiamo ottimizzato tutte le condizioni per saggiare i livelli di espressione miRNA-489 nei campioni dei pazienti di cancro al seno. A tal fine, abbiamo utilizzato uno scavo con l'etichetta bloccato sonda di acido nucleico (LNA) nel nostro esperimento. Alcuni dei suoi nucleotidi avevano una modifica LNA, cioè, un ponte che collega metilene 'atomo di ossigeno e 4' del 2 atomi di carbonio dello scheletro ribosio che fissa il nucleotide tale che rimanga "blocchi" dopo ibridazione. Come risultato, è molto più difficileper il complesso ibridizzato denaturare 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo di questo studio era di determinare il livello di espressione dei miRNA nei tessuti di cancro al seno utilizzando miRNA ibridazione in situ. Si deve notare che in questo esperimento, tutte le condizioni sono stati ottimizzati per il tessuto del cancro al seno. Ulteriore ottimizzazione potrebbe essere richiesto per altri tipi di tessuto. Tutte le soluzioni devono essere effettuate con acqua DEPC e tutti i contenitori da utilizzare devono essere risciacquati con acqua DEPC trattati e successivamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
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