ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em> באתרו</em> כלאה
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
סרטן השד הוא בין סוגי הסרטן הנפוצים ביותר המשפיעים על האוכלוסייה הנשית על פני הגלובוס. יותר מ -1.3 מיליון מקרים של סרטן השד מדווחים מדי שנה ברחבי עולם 1,2. למרות תאים סרטניים נחשבו באופן מסורתי כמו ביולוגית הומוגנית מאוד שגשוג, זה הפך להיות ברור כי סרטן השד הוא גנטי קליני הטרוגנית. עמידות לתרופות אנטי סרטניות רווחות היא סימן היכר של סרטן השד מתקדם, שמובילה את התמותה ברוב המכריע של מטופלים באמצעות הסיוע של גרורות מרחק התקדמות וסרטן 3.
מיקרו RNA (miRNAs) הם קבוצה של מולקולות RNA קטנות כ 22 נוקליאוטידים המווסתים ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום mRNA או בתיווך mRNA השפלה 4. יותר מ -2,000 miRNAs השונה עד כה זוהה בבני אדם, אשר מקושרים מחל אנושיות 5. מערך הולך וגדל של מחקרים havהדואר הוכיח כי miRNAs יכול לתפקד כמו מוטציות מדכאי גידול ובדר"כ dysregulated בגידולים 6. miRNAs מאוד להשפיע כל tumorigenesis העיקרי על ידי שליטה על הרגולטורים העיקריים של התקדמות מחזור התא, הזדקנות, אפופטוזיס autophagy, יחד עם אלה של תנועתיות תאים סרטניים, פלישה גרורה 7.
ביטוי Aberrant מירנה נקשר גם עם השלכות קליניות כגון במה, בידול, הפרוגנוזה ואת תגובה לטיפול אדג'ובנטי 8. בפרט, גדל ביטוי miR-146 הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה בחולי סרטן ריאות 9. מחקר אחר הראה כי ביטוי אבוד של מירנה-let7b קשור פנוטיפים ממאירים, וכתוצאה מכך, 6 הישרדות עניה. הבנת הסוגים של תאים ומבנים מבטאים miRNAs היא חלק חשוב להבין את המכניקה שדרכו שינויים בתא השפעת ביטוי מירנהרקמת פנוטיפים 10. miRNAs מסוים מצא להיות מופרשים בתאי סטרומה נלקח על ידי תאי אפיתל ולפעול עליהם במיוחד את המטרות שלהם. באותה רוח, miR-212 ומיר-132 מופרשים על ידי stroma ולהסדיר את אינטראקציות סטרומה אפיתל הנדרשים תולדה ductal במהלך התפתחות בלוטת החלב 11. המטרה הכללית של מאמר זה היא להסביר פרוטוקול מפורט לזהות ביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לנו אופטימיזציה כל התנאים כדי assay את רמות ביטוי מירנה-489 בדגימות חולות סרטן השד. לשם כך, השתמשנו DIG שכותרתו נעול חומצות גרעין (LNA) בדיקה בניסוי שלנו. חלק נוקלאוטידים המקורי היה שינוי LNA, כלומר, גשר מתילן חיבור 'אטום חמצן 4' 2 אטום פחמן של עמוד השדרה ריבוז שמתקן נוקלאוטיד כזה שהוא נשאר "נעול במקום" לאחר כלאה. כתוצאה מכך, זה הרבה יותר קשהעבור מתחם ההכלאה לפגל 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את רמת הביטוי מירנה ברקמות סרטן השד באמצעות מירנה הכלאה באתרה. יש לציין כי בניסוי זה, כל התנאים היו אופטימיזציה עבור רקמת סרטן השד. אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש סוגי רקמות אחרות. כל הפתרונות חייב להיעשות עם מים DEPC וכל מכולות לשמש י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
