Clinicopathological Analyse von miRNA Expression in Mammakarzinomen von miRNA Verwendung<em> In Situ</em> Die Hybridisierung
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Brustkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren in der ganzen Welt die weibliche Bevölkerung zu beeinflussen. Mehr als 1,3 Millionen Fälle von Brustkrebs werden jedes Jahr weltweit 1,2 berichtet. Obwohl Tumorzellen traditionell als biologisch homogen und hochproliferative angesehen worden sind, hat sich gezeigt, dass Brustkrebs ist genetisch und klinisch heterogen. Der Widerstand gegen vorherrschende Krebsmedikamente ist ein Markenzeichen von fortgeschrittenem Brustkrebs, in der Mehrzahl der Patienten durch die Erleichterung der Tumorprogression und Metastasierung Abstand 3 auf die Mortalität führt.
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von kleinen RNA – Moleküle , etwa 22 Nukleotide lang , die die Genexpression regulieren , indem mRNA – Translation zu blockieren oder zu vermitteln mRNA – Abbau 4. Mehr als 2.000 verschiedene miRNAs sind bisher beim Menschen identifiziert worden, die für die menschliche Krankheiten 5 verbunden sind. Eine wachsende Reihe von Studien have gezeigt , dass miRNAs als Onkogene und Tumorsuppressoren wirken können und in Tumoren 6 häufig dysreguliert. miRNAs stark die gesamte Primär tumorigenesis auswirken , indem die wichtigsten Regulatoren des Zellzyklus zu steuern, Seneszenz, Apoptose und autophagy, zusammen mit denen der Tumorzellbeweglichkeit, Invasion und Metastasierung 7.
Aberrant miRNA – Expression wurde auch mit klinischen Auswirkungen wie Stadium, Differenzierung, Prognose und das Ansprechen auf adjuvante Therapie 8 verbunden. Insbesondere erhöht miR-146 – Expression mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit Lungenkrebs 9 korreliert. Eine andere Studie hat gezeigt , dass verloren Expression von miRNA-let7b maligne Phänotypen verbunden ist und folglich schlechte Überleben 6. die Typen von Zellen und Strukturen zu verstehen, dass miRNAs ist ein wichtiger Teil des Verständnisses der Mechanik, durch die Veränderungen in der miRNA-Expression beeinflussen Zelle ausdrücken undGewebe Phänotypen 10. gefunden bestimmte miRNAs in Stromazellen sezerniert werden, werden von Epithelzellen aufgenommen und gezielt auf ihre Ziele handeln. In die gleiche Richtung, miR-212 und miR-132 werden von Stroma und regeln die epithelial-Stroma – Interaktionen für duktale Auswuchs während Brustdrüse Entwicklung 11 erforderlich abgesondert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, ein detailliertes Protokoll zu erklären miRNA – Expression in Brustkrebsgewebe durch miRNA in – situ – Hybridisierung zu detektieren. Wir haben alle Bedingungen optimiert, um die Ebenen der miRNA-489-Expression zu untersuchen bei Brustkrebs Patientenproben. Zu diesem Zweck verwendeten wir ein markiertes DIG-Nukleinsäure (LNA) -Sonde in unserem Experiment verriegelt. Einige seiner Nukleotide hatte eine LNA Modifikation, das heißt, eine Methylenbrücke der 2 'Sauerstoffatom und 4' Kohlenstoffatom der Ribose-Backbone verbindet, die das Nukleotid fixiert, so dass sie "eingerastet" bleibt nach der Hybridisierung. Als Ergebnis ist es viel schwierigerfür die hybridisierten Komplexes 12,13 zu denaturieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel dieser Studie war es, die Höhe der miRNA – Expression in Brustkrebsgewebe mit miRNA in – situ – Hybridisierung zu bestimmen. Es ist zu beachten, dass in diesem Experiment sind alle Bedingungen für die Brustkrebsgewebe optimiert. Eine weitere Optimierung könnte für andere Gewebetypen erforderlich. Alle Lösungen müssen mit DEPC Wasser hergestellt werden und alle Behälter verwendet werden, sollten mit DEPC behandeltem Wasser und anschließend autoklaviert gespült werden. Selbst geringe RN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
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