Klinisk-patologisk analyse af miRNA Expression i Breast Cancer væv ved hjælp miRNA<em> In Situ</em> Hybridisering
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Brystkræft er blandt de mest almindelige maligne sygdomme, der påvirker den kvindelige befolkning over hele kloden. Over 1,3 millioner tilfælde af brystkræft rapporteres hvert år på verdensplan 1,2. Selv tumorceller har traditionelt været betragtet som biologisk homogen og yderst proliferativ, er det blevet klart, at brystkræft er genetisk og klinisk heterogen. Modstand mod fremherskende lægemidler mod cancer er kendetegnende for avancerede brystkræft, hvilket fører til dødeligheden i de fleste patienter gennem sin lettelse af kræft progression og afstand metastaser tre.
MikroRNA'er (miRNA) er en klasse af små RNA-molekyler omkring 22 nukleotider lange, der regulerer genekspression ved at blokere mRNA-translation eller mediering mRNA nedbrydning 4. Mere end 2.000 forskellige miRNA er hidtil blevet identificeret hos mennesker, som er knyttet til sygdomme hos mennesker 5. Et stigende antal undersøgelser have påvist, at miRNA kan fungere som onkogener og tumor undertrykkere og er ofte dysreguleret i tumorer 6. miRNA kraftigt påvirke hele den primære tumorigenese ved styring de store regulatorer af cellecyklusprogression, ældning, apoptose og autophagy, sammen med de af tumorcellemotilitet, invasion og metastase 7.
Afvigende miRNA udtryk er også blevet forbundet med kliniske implikationer såsom scenen, differentiering, prognose og respons på adjuverende behandling 8. Især steg MIR-146-ekspression er korreleret med dårlig prognose i lungekræftpatienter 9. En anden undersøgelse har vist, at mistet ekspression af miRNA-let7b er forbundet med maligne fænotyper og følgelig ringe overlevelse 6. Forståelse af de typer af celler og strukturer, der udtrykker miRNA er en vigtig del af at forstå mekanikken hvorigennem ændringer i miRNA udtryk indflydelse celle ogvæv Fænotypers 10. Visse miRNA fundet at blive udskilt i stromale celler taget i af epitelceller og specifikt handle på deres mål. På samme måde, er miR-212 og miR-132 udskilles af stroma og regulere epitel-stromale interaktioner, der kræves for duktalt udvækst under mælkekirtlerne udvikling 11. Det overordnede formål med denne artikel er at forklare en detaljeret protokol til at opdage miRNA udtryk i brystkræft væv gennem miRNA in situ hybridisering. Vi har optimeret alle forhold at analysere niveauerne af miRNA-489-ekspression i brystkræft patientprøver. Til dette formål anvendte vi en grave mærket låst nukleinsyre (LNA) probe i vores eksperiment. Nogle af dens nukleotider havde en LNA modifikation, dvs. en methylenbro forbinder 2 'oxygenatom og 4' carbonatom af ribose backbone som fastsætter nukleotid, således at den forbliver "låses" fast efter hybridisering. Som følge heraf er det meget vanskeligerefor det hybridiserede kompleks til at denaturere 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne undersøgelse var at bestemme niveauet af miRNA ekspression i brystkræft væv under anvendelse miRNA in situ hybridisering. Det skal bemærkes, at i dette eksperiment blev alle forhold optimeret for brystkræft væv. Yderligere optimering kan være nødvendige til andre vævstyper. Alle løsninger skal foretages med DEPC vand, og alle beholdere, der skal anvendes, bør skylles med DEPC behandlet vand og efterfølgende autoklaveres. Selv lille RNase forurening kan forstyrre det endelige resulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
