Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em> In Situ</em> hybridisatie
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Borstkanker is de meest voorkomende kwaadaardige aandoeningen die de vrouwelijke bevolking over de hele wereld. Meer dan 1,3 miljoen gevallen van borstkanker worden elk jaar wereldwijd 1,2 gemeld. Hoewel tumorcellen worden traditioneel als biologisch homogeen en hoog proliferatieve beschouwd, is het duidelijk geworden dat borstkanker genetisch en klinisch heterogeen. Resistentie tegen heersende antikankergeneesmiddelen is een kenmerk van gevorderde borstkanker, wat leidt tot de sterfte in de meerderheid van patiënten via de facilitering van kankerprogressie en afstand metastase 3.
MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse kleine RNA- moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang die genexpressie reguleren door mRNA translatie te blokkeren of bemiddelen mRNA afbraak 4. Meer dan 2000 verschillende miRNAs dusver geïdentificeerd in de mens, die verband houden met menselijke ziekten 5. Een groeiend scala aan studies have aangetoond dat miRNAs kan functioneren als oncogenen en tumor suppressors en worden vaak verstoord bij tumoren 6. miRNAs aanzienlijke invloed hebben alle primaire tumorigenese door regeling van de belangrijkste regulatoren van celcyclusprogressie, senescentie, apoptose en autofagie, samen met die van tumorcel beweeglijkheid, invasie en metastase 7.
Afwijkende miRNA expressie is ook geassocieerd met klinische implicaties zoals stadium, differentiatie, prognose en respons adjuvante 8. Vooral een groter miR-146 expressie is gecorreleerd met slechte prognose bij longkankerpatiënten 9. Een andere studie heeft aangetoond dat verloren expressie van miRNA-let7b samenhangt met kwaadaardige fenotypes en derhalve slechte overleving 6. Inzicht in de typen cellen en structuren die miRNAs expressie is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waarmee veranderingen in miRNA expressie beïnvloeden cel enweefsel fenotypen 10. Bepaalde miRNAs gevonden te worden uitgescheiden in stromale cellen worden in genomen door epitheelcellen en specifiek inwerken op hun doelen. In dezelfde geest, miR-212 en miR-132 worden uitgescheiden door stroma en reguleren van de epitheliale-stromale interacties die nodig is voor ductaal uitgroei tijdens de ontwikkeling van de borstklier 11. De algemene doelstelling van dit document is een gedetailleerd protocol om miRNA expressie in borstkanker weefsels op te sporen door middel van miRNA in situ hybridisatie uit te leggen. We hebben alle omstandigheden geoptimaliseerd om de niveaus van miRNA-489 expressie in borstkanker patiëntenmonsters testen. Hiervoor gebruikten we een DIG gemerkte vergrendeld nucleïnezuur (LNA) probe in ons experiment. Sommige van de nucleotiden had een LNA modificatie, dat wil zeggen een methyleen brug tussen het 2 'zuurstofatoom en het 4' koolstofatoom van het ribose ruggengraat die de nucleotide zodat het blijft "vergrendeld" na hybridisatie vastgesteld. Daardoor is het veel moeilijkerhet gehybridiseerde complex te denatureren 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze studie was het niveau van miRNA expressie in borstkanker weefsels met behulp miRNA in situ hybridisatie bepalen. Er zij op gewezen dat in dit experiment alle omstandigheden werden geoptimaliseerd voor borstkankerweefsel. Verdere optimalisatie kan het nodig zijn andere weefseltypes. Alle oplossingen moeten worden gemaakt met DEPC water en alle containers worden gebruikt moet worden gespoeld met DEPC behandeld water en vervolgens geautoclaveerd. Zelfs kleine RNase vervuiling kunnen interfereren …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
