Análise clínico-patológico de miRNA Expressão em cancro da mama tecidos usando miRNA<em> In Situ</em> Hibridização
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
O cancro da mama é um dos tumores malignos mais comuns que afetam a população feminina em todo o mundo. Mais de 1,3 milhões de casos de câncer de mama são notificados a cada ano no mundo 1,2. Embora as células tumorais têm sido tradicionalmente considerados como biologicamente homogênea e altamente proliferativa, tornou-se evidente que o câncer de mama é geneticamente e clinicamente heterogênea. A resistência aos fármacos anticancerígenos prevalentes é uma característica de cancros da mama avançado, conduzindo à mortalidade na maioria dos pacientes através da sua promoção da progressão do cancro e metástases à distância 3.
MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenas moléculas de RNA de aproximadamente 22 nucleótidos de comprimento que regulam a expressão do gene através do bloqueio da tradução do mRNA ou mediar a degradação de ARNm 4. Mais de 2.000 miRNAs diferentes foram até agora identificados em humanos, que estão ligadas a doenças humanas 5. Uma crescente variedade de estudos have demonstraram que miARN pode funcionar como oncogenes e supressores tumorais e são frequentemente desreguladas em tumores 6. miARNs impacto fortemente toda a tumorigénese principal, controlando as principais reguladores da progressão do ciclo celular, senescência, apoptose e autofagia, juntamente com os da motilidade de células tumorais, invasão e metástase 7.
Expressão aberrante miRNA foi também associada a implicações clínicas, tais como estágio, diferenciação, prognóstico e resposta ao adjuvante terapia 8. Em particular, o aumento da expressão de miR-146 está correlacionada com mau prognóstico em pacientes com câncer de pulmão 9. Outro estudo demonstrou que a expressão perdida de miRNA-let7b está ligada a fenótipos malignas e, consequentemente, pior sobrevida 6. Compreender os tipos de células e estruturas que expressam miRNAs é uma parte importante de compreender os mecanismos através dos quais alterações nas células de expressão influência miRNA etecido fenótipos 10. Certos miARNs encontrado para ser segregado em células do estroma são tomadas por células epiteliais e, especificamente, agir sobre os seus objectivos. Na mesma linha, o miR-212 e miR-132 que são segregadas por estroma e regular as interacções epiteliais-estromal requeridas para crescimento ductal durante 11 desenvolvimento da glândula mamária. O objetivo geral deste trabalho é explicar um protocolo detalhado para detectar a expressão de miRNA em tecidos de cancro da mama através de miRNA hibridização in situ. Temos todas as condições optimizadas para ensaiar os níveis de expressão de miARN-489 em amostras de pacientes de cancro da mama. Para este fim, foi utilizado um DIG marcado bloqueado ácido sonda (LNA) nucleico em nosso experimento. Alguns dos seus nucleótidos tinha uma modificação LNA, que é, uma ponte metileno que liga 'átomo de oxigénio e 4' a 2 átomos de carbono do esqueleto ribose que fixa as sequências de nucleótidos de tal modo que ele fica "bloqueado no lugar" após a hibridização. Como resultado, é muito mais difícilpara o complexo hibridado para desnaturar 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste estudo foi determinar o nível de expressão miRNA em tecidos de câncer de mama utilizando miRNA hibridização in situ. Deve ser notado que nesta experiência, todas as condições foram optimizadas para o tecido do cancro da mama. Optimização adicional pode ser necessário para outros tipos de tecidos. Todas as soluções deve ser feita com água com DEPC e todos os recipientes a ser usado deve ser lavado com água tratada com DEPC e subsequentemente autoclavadas. Mesmo fraca contaminaçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
