Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em> In Situ</em> La hibridación
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes que afectan a la población femenina en todo el mundo. Más de 1,3 millones de casos de cáncer de mama cada año se registran en todo el mundo 1,2. Aunque las células tumorales han sido tradicionalmente considerado como biológicamente homogénea y altamente proliferativas, se ha hecho evidente que el cáncer de mama es genéticamente y clínicamente heterogéneos. La resistencia a medicamentos contra el cáncer prevalentes es una característica de los cánceres de mama avanzados, que conduce a la mortalidad en la mayoría de los pacientes a través de su facilitación de la progresión del cáncer y la metástasis a distancia 3.
MicroARNs (miRNAs) son una clase de moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan la expresión génica mediante el bloqueo de la traducción del ARNm o la mediación de la degradación del ARNm 4. Más de 2.000 diferentes miRNAs Hasta ahora se han identificado en humanos, que están vinculados a enfermedades humanas 5. Un creciente gama de estudios VHAe demostró que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes y supresores tumorales y son a menudo mal regulada en tumores 6. miRNAs afecta fuertemente la totalidad de la tumorigénesis primaria mediante el control de los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, la senescencia, la apoptosis y la autofagia, junto con los de la motilidad de células tumorales, invasión y metástasis 7.
La expresión aberrante de los genes miARN se ha asociado también con implicaciones clínicas como la etapa, la diferenciación, el pronóstico y respuesta al tratamiento adyuvante 8. En particular, el aumento de expresión de miR-146 se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón 9. Otro estudio ha demostrado que la expresión perdida de miARN-let7b está vinculada a fenotipos malignos y, en consecuencia, una baja supervivencia 6. La comprensión de los tipos de células y estructuras que expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos a través del cual las alteraciones en la célula de influir en la expresión de los genes miARN ytejido fenotipos 10. Ciertos miRNAs encontrado para ser secretada en las células del estroma se toman en por las células epiteliales y actúan específicamente sobre sus objetivos. En la misma línea, el miR-212 y miR-132 son secretadas por estroma y regulan las interacciones epitelio-estroma necesarios para derivación ductal durante el desarrollo de la glándula mamaria 11. El objetivo general de este trabajo es explicar un protocolo detallado para detectar la expresión de los genes miARN en tejidos de cáncer de mama a través de miRNA hibridación in situ. Hemos optimizado todas las condiciones para someter a ensayo los niveles de expresión de los genes miARN-489 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se utilizó una DIG marcado bloqueado sonda de ácido nucleico (LNA) en nuestro experimento. Algunos de sus nucleótidos tenían una modificación LNA, es decir, un puente de metileno que conecta 'átomo de oxígeno y 4' de la 2 átomo de carbono del esqueleto de ribosa que fija el nucleótido de tal manera que permanece "bloqueado en su lugar" después de la hibridación. Como resultado, es mucho más difícilpara el complejo hibridado para desnaturalizar 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de los genes miARN en los tejidos de cáncer de mama utilizando miARN hibridación in situ. Hay que señalar que en este experimento, todas las condiciones se optimizaron para el tejido de cáncer de mama. Una optimización adicional puede ser necesario para otros tipos de tejidos. Todas las soluciones deben hacerse con agua DEPC y todos los contenedores que se utilicen deben ser enjuagados con agua tratada con DEPC y posteriormente en autoclave….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
