Klinisk-patologisk analys av miRNA uttryck i bröstcancer vävnader med hjälp av miRNA<em> In Situ</em> Hybridisering
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Bröstcancer är en av de vanligaste maligniteter påverkar den kvinnliga befolkningen över hela världen. Över 1,3 miljoner fall av bröstcancer rapporteras varje år i världen 1,2. Även tumörceller har traditionellt betraktas som biologiskt homogen och mycket proliferativ, har det blivit uppenbart att bröstcancer är genetiskt och kliniskt heterogen. Resistens mot rådande läkemedel mot cancer är ett kännetecken för avancerade bröstcancer, vilket leder till dödlighet hos majoriteten av patienterna genom sin underlättande av cancer progression och avstånd metastasering 3.
MicroRNAs (miRNA) är en klass av små RNA-molekyler cirka 22 nukleotider långa som reglerar genuttryck genom att blockera mRNA-translation eller medla mRNA nedbrytning 4. Mer än 2.000 olika miRNA har hittills identifierats hos människor, som är kopplade till mänskliga sjukdomar 5. En ökande samling av studier have visade att miRNA kan fungera som onkogener och tumörsuppressorer och ofta oreglerad i tumörer 6. miRNA påverkar starkt hela den primära tumörgenes genom att styra de stora regulatorer av cellcykelprogression, senescens, apoptos och autophagy, tillsammans med de av tumörcellrörlighet, invasion och metastas 7.
Aberrant miRNA uttryck har också i samband med kliniska konsekvenser såsom scen, differentiering, prognos och svar på adjuvant terapi 8. Framför allt ökade miR-146 uttryck korreleras med dålig prognos i lungcancerpatienter 9. En annan studie har visat att förlorat uttryck av miRNA-let7b är kopplad till maligna fenotyper och följaktligen dålig överlevnad sex. Förstå de typer av celler och strukturer som uttrycker miRNA är en viktig del av att förstå mekanismerna genom vilka förändringar i miRNA expressions inflytande cell ochvävnad fenotyper 10. Vissa miRNA befunnits utsöndras i stromaceller vidtas av epitelceller och specifikt agera utifrån sina mål. På samma sätt är miR-212 och MIR-132 som utsöndras av stroma och reglera epitelceller-stromala interaktioner som krävs för duktal utväxt under bröstkörteln utveckling 11. Det övergripande syftet med detta dokument är att förklara ett detaljerat protokoll för att upptäcka miRNA uttryck i bröstcancervävnader genom miRNA in situ hybridisering. Vi har optimerat alla villkor för att analysera halterna av miRNA-489 uttryck i bröstcancerpatientprover. För detta ändamål använde vi en DIG-märkt låst nukleinsyra (LNA) sonden i vårt experiment. Några av dess nukleotider hade en LNA modifiering, det vill säga, en metylengrupp bro som förbinder två 'syreatom och 4' kolatomen i ribosen ryggraden som fixerar nukleotiden så att den förblir "låst på plats" efter hybridisering. Som ett resultat, är det mycket svårareför den hybridiserade komplexet att denaturera 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denna studie var att bestämma nivån av miRNA uttryck i bröstcancer vävnader med hjälp av miRNA in situ hybridisering. Det måste noteras att i detta experiment, var alla betingelser optimerade för bröstcancervävnad. Ytterligare optimering kan krävas för andra vävnadstyper. Alla lösningar måste göras med DEPC vatten och alla behållare som ska användas bör sköljas med DEPC-behandlat vatten och därefter autoklaveras. Även lätt RNas föroreningar kan störa det slutliga resultatet av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
