In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Eine Fülle von experimentellen Daten haben gezeigt, dass die Epikard kritischen Schritte in der Herzentwicklung beeinflusst. Während der Entwicklung gibt das Septum transversum Aufstieg zu einem Klumpen von Mesothelzellen als Proepikard bekannt 1-4. Zellen aus dem Proepikard dann wandern und das Myokard Bildung der Epikard umhüllen. Im Anschluss daran durchlaufen eine Untergruppe von Zellen epikardialen EMT was zu einer Population von wandernd Epikard-abgeleiteten Zellen (EPDCs), der anschließend das Myokard eindringen. Genetic sowie retrovirale lineage Verfolgungsexperimente haben gezeigt, dass EPDCs in verschiedenen Abstammungen, einschließlich glatter Muskelzellen differenzieren, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten (falls vorhanden). Daher EPDCs tragen wesentlich zur Entwicklung der Koronargefäße und myokardiale Architektur 1,2,4-9. Darüber hinaus ist das Epikard wesentlich für die Entwicklung der ventrikulären Preßkörperschicht 10-12. Für example Gittenberger-de Groot et al. zeigten , daß das Auswachsen der Proepikard Hemmung führt zu einer Reihe von Defekten, wie einer dünnen Myokard defizienten Umschlingung des Herzens und abnormal interventrikulären Septum Bildung und als Ergebnis 13 embryonaler Letalität. Parakrine Faktoren aus dem embryonalen Epikard sezerniert modulieren Kardiomyozyten Proliferation und Differenzierung. Übereinstimmend damit Epikard spezifische Deletion von Signalwegen wie Retinsäure (RA), Fibroblasten – Wachstumsfaktoren (FGFs) und Wnt / β-Catenin in Folge fehlerhaften myocardial Wachstum und embryonaler Letalität 14-16.
Obwohl das Epikard in erwachsenen Herzen Ruhe sein wurde geglaubt, haben neuere Studien gezeigt , dass das Entwicklungsprogramm 17,18 folgenden Herzschädigung in das Epikard reaktiviert. Nach der Aktivierung durchlaufen die Zellen schnelle Verbreitung und EMT, die in EPDC Bildung führen. Diese Zellen zeigen die capacity in Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu differenzieren , jedoch nicht Kardiomyozyten oder Endothelzellen 18. Darüber hinaus scheiden die EPDCs proangiogenic Faktoren, die Hilfe bei der Vaskularisierung des verletzten Bereich und somit durch eine Verringerung der Infarktgröße verbesserte Herzfunktion erleichtern. Aufgrund dieser Befunde wurde die Epikard Interesse bei der Untersuchung von Herz-Kreislauf-Entwicklung, der Krankheit und Regeneration gewonnen.
Transgene Technologie hat die medizinische Forschung im 21. Jahrhundert revolutioniert. Mit Hilfe von transgenen Technologien, imitiert erkrankten Maus-Modellen den menschlichen Zustand metabolisch und pathophysiologisch erfolgreich entwickelt. Doch in diesen Mutanten die epikardiale Zellverhalten zu studieren war eine Herausforderung vor allem wegen der frühen embryonalen Letalität gewesen. Angesichts der bedeutenden Rolle, die das Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration spielt, haben wir ein in – vitro – Kultursystem für die Maus etabliert epicardial-Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht die langfristige Kultur der epikardialen Zellen und erleichtert die detaillierte Untersuchung der zwei wichtige Eigenschaften des Epikard: ihre Fähigkeit zur Migration und zu differenzieren. Die exzidierten Ventrikel von der Maus konnte auf Kollagen-Gelen gezüchtet werden, die verwendet werden können, um Migrationsassays durchzuführen. Wird in einer 3D – Matrix kultiviert, die das Kollagen-reiche extrazelluläre Matrix der subepikardialen Schicht rekapituliert Physiologie der in vivo – Zelle besser repliziert. Alternativ können sie auf der Kammer gleitet, um kultiviert werden, um eine epikardiale Monoschicht zu schaffen, die dann für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann. Diese Monoschicht kann verwendet werden für tight junction-Proteine zu färben, die Erkenntnisse über die Fähigkeit des Epikard liefert EMT zu unterziehen, die für die Migration von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus können auch auf diesen Zellen durchgeführt Experimente Differenzierung werden. Weiterhin kann Genexpressionsprofil durch Extrahieren von RNA aus den Zellen analysiert werden, undDurchführung quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Schließlich könnten auch die Monoschichten mit Mitteln, durch eine molekulare Analyse gefolgt behandelt werden für potentielle Therapeutika zu testen. Stellen Sie sich diese epikardialen Kultursystem bietet uns die Möglichkeit, zu visualisieren und molekularen Daten sammeln, die unser Verständnis über epikardiale Entwicklung fördert.
Ein weiteres wünschenswertes Merkmal dieses Verfahrens ist, dass es einfach ist und keine aufwendige Einrichtung erforderlich ist. Kurz gesagt, werden die Embryonen bei E11,5 oder E12,5 folgenden geerntet, die das Herz herausgeschnitten wird. Die Ventrikel sind dann kultiviert entweder auf Kollagen-Gel oder eine Kammer gleitet. Anschließend können diese Zellen verwendet werden, stromabwärts Experimente durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist entscheidend, Techniken zu entwickeln, die die Untersuchung der Epikard erleichtern die zunehmende Bedeutung des Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration zu sorgen. Die epikardiale Kultursystem stellt erhebliche Vorteile für epikardiale Forschung.
Eine alternative Möglichkeit epikardialen Zellen zu isolieren, ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) eingesetzt werden. Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von epikardialen Marker (oder Epikard-Zell-spezifisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus DUKE-NUS Graduate Medical School Singapore, Goh Stiftung und Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-NRFF2016-01) zu Manvendra K. Singh unterstützt.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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