במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
שפע של נתוני ניסוי הדגים כי epicardium משפיע שלבים קריטיים בפיתוח לב. במהלך הפיתוח, מחצה transversum מוליד גוש של תאים mesothelial המכונה proepicardium 1-4. תאים מן proepicardium מכן להעביר ומעטפת שריר הלב להרכיב את epicardium. בעקבות זאת, תת קבוצה של תאים epicardial לעבור והוליד EMT לאוכלוסייה הנדידה של תאים שמקורם epicardium (EPDCs) כי לאחר מכן לפלוש שריר הלב. שושלת גנטית וכן retroviral התחקות ניסויים הוכיחה כי EPDCs להתמיין שושלות שונות, כולל תאי שריר חלק, פיברובלסטים, אנדותל תאי cardiomyocytes (אם בכלל). לכן EPDCs לתרום רבות להתפתחות של כלי הדם הכליליים ואדריכלות שריר הלב 1,2,4-9. יתר על כן, epicardium חיוני לפיתוח השכבה הקומפקטית חדרית 10-12. לקבלת דוארxample Gittenberger-דה גרוט et al., הוכיח כי עיכוב התולדה של proepicardium מוביל מערך של ליקויים כגון שריר לב רזה, looping הלקוי של לב היווצרות מחץ interventricular נורמלית וכתוצאה מכך, 13 הקטלניות עובריות. גורמי paracrine מופרשי epicardium העוברי לווסת התפשטות cardiomyocyte והבחנה. בקנה אחד עם זו, מחיקה ספציפי epicardium של מסלולי איתות כגון חומצה רטינואית (RA), גורמי גדילה פיברובלסטים (FGFs) ו Wnt / β-קטנין הביאה לצמיחת שריר לב פגומה קטלנית עוברי 14-16.
למרות epicardium היה ככל הנראה רדום לבבות מבוגרים, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תכנית התפתחותית מחדש של epicardium הבא לב פציעת 17,18. לאחר ההפעלה, התאים עוברים התפשטות מהירה EMT שתוצאתן היווצרות EPDC. תאים אלה מציגים את capacity להתמיין פיברובלסטים ותאי שריר חלק אבל לא cardiomyocytes או תאי האנדותל 18. בנוסף, EPDCs מפריש גורמי proangiogenic שסיוע של כלי הדם של האזור הפגוע ובכך להקל על תפקוד לב משופר על ידי הקטנת הגודל האוטם. בשל ממצאים אלה, epicardium צברה עניין במחקר של פיתוח, מחלות לב וכלי דם והתחדשות.
טכנולוגיה מהונדסת יש מהפכה במחקר רפואי במאות ה -21. בעזרת טכנולוגיות מהונדסות, במודלים של עכברים חולים מחקו את המצב האנושי מבחינה מטבולית ו pathophysiologically פותחו בהצלחה. עם זאת, לומד את התנהגות התא epicardial מוטנטים אלה כבר אתגר בעיקר בשל הקטלניות עובריים מוקדם. בהתחשב תפקיד משמעותי כי epicardium משחק בפיתוח והתחדשות לב, הקמנו מערכת תרבות במבחנה לעכבר epicardiaתאי l. שיטה זו מאפשרת תרבות ארוכת הטווח של תאי epicardial ומקל על מחקר מפורט של שני המאפיינים החשובים של epicardium: יכולתו להעביר ולבדל. תעלות חדרי המוח נכרת מן העכבר יכול להיות מתורבת על ג'ל קולגן אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנהל מבחני הגירה. בתרבית במטריצה 3D כי משכפל את תאי מטריקס עשיר קולגן של השכבה subepicardial טוב משכפלת את הפיזיולוגיה תא vivo. לחלופין, הם יכולים להיות מתורבתים בשקופיות קאמריות כדי להקים monolayer epicardial אז מה שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים במורד זרם. בשכבה זו יכולה לשמש כדי להכתים חלבונים צומת חזק אשר יספק תובנות על היכולת של epicardium לעבור EMT שהוא חיוני עבור הגירה. בנוסף, ניסויים בידול יכול גם להתבצע על תאים אלה. יתר על כן, פרופיל ביטוי גנים יכול להיות מנותח על ידי חילוץ RNA מן התאיםביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR). לבסוף, monolayers יכול גם להיות מטופלות בעזרת חומרי ואחריו ניתוח מולקולרי לבדוק רפויים פוטנציאלי. להרכיב, מערכת תרבות epicardial זה מספקת לנו את ההזדמנות כדי להמחיש ולאסוף נתונים מולקולריים אשר מסייע להבנה על פיתוח epicardial.
עוד תכונה רצויה של שיטה זו היא שהיא פשוטה ולא הגדרה מורכבת נדרשת. בקיצור, את העוברים נקצרים בכל הבאה E11.5 או E12.5 בו הלב הוא נכרת. תעלות חדרי המוח אז בתרבית על ג'ל או קולגן או שקופיות קאמריות. כתוצאה מכך, התאים האלה יכולים לשמש כדי לבצע ניסויים במורד זרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה הוא מכריע לפתח טכניקות להקל על המחקר של epicardium כדי לשרת את המשמעות הגוברת של epicardium בפיתוח לב והתחדשות. מערכת התרבות epicardial תנוחות יתרונות משמעותיים למחקר epicardial.
דרך חלופית לבודד תאים epicardial היא להשתמש מיון התא המופעל פלואורסצנטי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מסינגפור הספר לרפואה בוגר DUKE-NUS, קרן גו וסינגפור המילגה NRF (NRF-NRFF2016-01) כדי Manvendra ק סינג.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
References
- Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
- Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
- Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
- Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
- Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
- Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
- Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
- Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms’ tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).
