モデルシアノバクテリア種のマークとマーカーレス変異体の生成
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
シアノバクテリアは、地球上のほぼすべての自然環境の中で見つかった細菌の進化的に古代と多様な門です。海洋生態系において、それらは特に豊富であり、炭素固定1の約半分を、海洋における窒素固定2と炭化水素生産3のトン数百万の大半は毎年を占め、多くの栄養素のサイクルで重要な役割を果たしています。葉緑体は、真核藻類や植物の光合成を担う細胞小器官は、宿主生物4に包まれたシアノバクテリアから進化した可能性があります。シアノバクテリアは、その多くが植物に保存されている、光合成、電子輸送5および生化学的経路の研究のための有用なモデル生物を証明しています。付加シアノバクテリアにおいてますます食品、バイオ6、電気7及びそれらのハイによる産業用化合物8の製造に使用されています太陽エネルギー9を用いて、バイオマスへの水とCO 2のghly効率的に変換します。多くの種はシアノバクテリアが潜在的に農業生産に影響を与えることなく、大規模に成長させることができたことを示唆し、最小限の栄養素と海水と非耕地で栽培することができます。特定の種も抗真菌、抗菌性及び抗癌化合物10,11を含む天然物の源です。
変異体を生成する能力は、シアノバクテリアの光合成、生化学および生理学、および産業用菌株の開発に不可欠なを理解するための鍵です。公表された研究の大部分は、目的の部位に抗生物質耐性カセットの挿入によって遺伝的に改変された株を生成します。これは、いくつかの抗生物質耐性カセットは、シアノバクテリアにおける使用のために利用可能であるように、株に導入され得る変異の数を制限します。抗生物質の再付与する遺伝子を含む株sistanceは、バイオ燃料および他の低価値製品12を製造するための唯一の費用効果的な手段である可能性が高い開放池の工業生産のために使用することができません。マークされていない変異体の生成は、これらの制限を克服します。マークされていない変異体は、意図的に含まれない限り、外来DNAを含有しない、複数回操作することができます。したがって、所望のように株のように多くの変更を生成することができます。また、修飾部位の下流の遺伝子上の極性効果は、生体13のより正確な修正を可能にする、最小限にすることができます。
変異株、削除対象の遺伝子に隣接するシアノバクテリアの染色体における領域と同一の2つのDNA断片を含有する自殺プラスミド（隣接領域の5 'および3'と呼ばれる）を生成するために最初に構成されています。二つの遺伝子は、これらの隣接領域間に挿入されます。これらの一つは、抗生物質耐性タンパク質をコードします。第二は、SacBを、PRODを符号化レバンスクラーゼuces、化合物は、スクロースに対する感受性を付与します。プロセスの最初の段階では、マークされた変異体は、いくつかの外来DNAを含む、すなわち株は、生成されます。プラスミド構築物は、シアノバクテリア細胞と混合し、DNAは、生物によって天然に取り込まれます。形質転換体は、適切な抗生物質およびPCRにより確認変異体の遺伝子型を含有する寒天プレート上での増殖によって選択されます。自殺プラスミドは、目的の菌株内で複製することはできません。したがって、任意の抗生物質耐性コロニーは、目的の遺伝子が染色体に挿入することにより組換え事象から生じます。マークされていない変異体を生成するために、マークされた変異体は、その後、ちょうど5 'および3'フランキング領域を含む第二の自殺プラスミドと混合されます。外来DNAの挿入が必要な場合は、これらのDNA断片の間に挿入された目的の遺伝子を含有するカセットを有する領域に隣接する5 'および3'からなるプラスミドを用いることができます。セレctionは、ショ糖を含有する寒天プレート上での成長によるものです。 sacB遺伝子産物が発現されたときに、スクロースを細胞に致死的であるように、生存細胞のみがショ糖感受性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子に加えて、外に再結合されていることにより第2の組換え事象が発生したものであり、染色体とプラスミド上に。組換え交換の結果として、隣接する領域と、それらの間のいずれかのDNAが染色体に挿入されています。
我々は成功しシネコシスティスの同じ系統で複数の染色体の変異を生成するために、これらのメソッドを使用しています。 （以下、 シネコシスティスという）PCC6803 13,14は 、関心対象13の遺伝子に、遺伝子カセットの発現のための単一点突然変異を導入します。マークされていないノックアウトの生成はシネコシスティス 15,16、詳細な方法で私たちの仕事の前に実証されてきたが、によって支援重要なステップのビジュアルプレゼンテーションは、公開されていません。また、別のモデルのラン藻、 シネココッカス属にマークされたノックアウトを生成するために同じ方法を適用しました。 PCC7002（以下、 シネココッカスと呼ばれます）。このプロトコルは、変異体およびこれらの株を検証し、保存するための迅速なプロトコルを生成するための明確な、簡単な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マークされていない変異体の世代の中で最も重要な手順は次のとおりです。1）慎重なプラスミドのデザインのみ標的領域が改変されていることを確認します。 2）特に、培養された場合、スクロース上のサンプルは、無菌のままであることを保証します。 3）24時間後に寒天を加えた抗生物質を添加した抗生物質を欠くBG11寒天プレート上に最初にマークされた変異体の生成のためのめっき形?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、財政支援のため、インド政府環境サービス協会教育トラスト、ケンブリッジシンバイオファンドにおける合成生物学と社会正義とエンパワーメント省に感謝しています。
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
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