Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral
Summary
Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.
Abstract
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Introduction
Divulgação de células tumorais a partir do tumor mamário primário tem sido demonstrado que envolvem as células de tumor não apenas, mas células hospedeiras estromais incluindo macrófagos e células endoteliais. Além disso, a vasculatura tumoral é anormal, com um aumento da permeabilidade. Assim, determinar como células tumorais, macrófagos e células endoteliais interagem para mediar a permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral no microambiente do tumor primário é importante para a metástase compreensão. Compreendendo a cinética da permeabilidade vascular, intravasamento de células tumorais e o mecanismo de sinalização subjacente de interacções multicelulares no microambiente tumoral pode fornecer a informação crucial no desenvolvimento e administração de terapias anti-cancerosas.
O principal meio de estudar a permeabilidade vascular do tumor in vivo tem sido a medição de corantes extravasculares, tais como azul de Evans 2, dextranos de elevado peso molecular (155 kDa)3 e fluoróforo ou proteínas radiofármaco-conjugados (incluindo a albumina) 4 em pontos fixos de tempo após a injecção do corante. Avanços na microscopia, modelos animais e corantes fluorescentes permitiram a visualização de processos celulares e permeabilidade vascular em animais vivos por meio de microscopia intravital 5.
Imaging animal vivo com a aquisição de imagens estáticas, ou sequências de curto lapso de tempo ao longo de vários pontos de tempo não permite a compreensão completa dos eventos dinâmicos no microambiente do tumor 6,7. De facto, a aquisição de imagem estática ao longo de 24 horas demonstraram que a vasculatura tumoral é permeável, no entanto, a dinâmica da permeabilidade vascular não foi observada 6. Assim, estendido de imagem contínua de lapso de tempo de até 12 horas capta a cinética de eventos dinâmicos no microambiente do tumor.
Este protocolo descreve o uso de estendido multiphot time-lapseem microscopia intravital para estudar eventos multicelulares dinâmicos no microambiente tumoral. Vários tipos de células no microambiente do tumor são marcadas com corantes injectáveis ou usando animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes. Utilizando um cateter na veia da cauda corantes vasculares ou proteínas pode ser injectado após o início da imagiologia para adquirir dados de cinética de eventos multicelulares no microambiente tumoral. Para imagens de células vivas do tumor mamário é exposto através da preparação cirúrgica de um retalho de pele. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipado com múltiplos tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores 8. Ao usar filtros apropriados, um algoritmo de subtracção possibilita 4 detectores PMT para adquirir sinais fluorescentes 5 no microambiente tumoral, simultaneamente 9. microscopia de alta resolução multiphoton intravital captura de imagem resolução única célula de interações tumor-estroma no microambiente tumoral, levando a uma melhor understanding da permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral 10-13. Especificamente, imagiologia intravital reveladas altamente localizadas transientes, eventos de permeabilidade vascular estendidos que ocorrem selectivamente em locais de interacção entre uma célula tumoral, um macrófago e uma célula endotelial (definido como o microambiente do tumor de metástase, TMEM 14) 13. Além disso, intravasation células tumorais ocorre apenas em TMEM e é espacialmente e temporalmente correlacionada com a permeabilidade vascular 13. resolução única célula da dinâmica destes eventos foi possível através do uso de microscopia multiphoton lapso de tempo prolongado de células com marcação fluorescente no microambiente tumoral.
Protocol
Representative Results
Discussion
interacções celulares que ocorrem espontaneamente no microambiente do tumor pode levar a alterações na motilidade de células tumorais e intravasamento. De alta resolução de imagem intravital do tecido tumoral ao vivo permite a visualização da dinâmica multicelulares que podem ser 10,13,24 altamente transitória. Ponto final em ensaios in vivo ou imagens de lapso de tempo adquiridos com pontos de tempo discreto pode fornecer informações essenciais sobre mecanismos moleculares de p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela mama Departamento de Defesa Cancer Research Program sob o número prêmio (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, e do Programa Integrado Imaging.
Materials
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1 x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |
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