This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade afetam Ca 2+ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na +, Ca 2+ e os canais de K + e Na + -Ca 2+) e proteínas de permutador de Ca 2+ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca 2 + -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca 2+ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca 2+ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível de Ca2 + intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação de Ca2 +, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.
Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração 1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na +, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de Ca2 + (LTCCs) e influxo de Ca2 + através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação de Ca2 + através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica de Ca2 + a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca 2+ citosólica de Ca2 + promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração 3. Por outro lado, o Ca2 + citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da Ca2 + -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na + / Ca2 + e o permutador de plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Consequentemente, o declínio no Ca 2+ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento 1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 – 90% de remoção citosólica de Ca2 + na maioria das células de mamífero do coração 1. Como tal, anormal manipulação de Ca 2+ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente 1-4.
<p class="jove_content"> Na realidade, livre citosólica de Ca2 +, que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca 2+ e a maioria dos Ca 2+ é obrigado a intracelulares de Ca2 + buffers 5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca 2+ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. 5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca 2+ buffers 5,6,7. Além disso, o Ca 2+ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca 2+ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes de Ca2 + 7) e a alteração no Ca 2+ causa adicional de ligação "libertação" de Ca2 + livre para o citosol, os resultados nas alterações do Ca2 + intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca 2+ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias 8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca 2+ e de tamponamento miofilamentos Ca 2+ sensibilidade 8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o Ca2 + intracelular e a afinidade de ligação a manipulação de Ca2 +, desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes de Ca2 +, Ca2 +, libertação anormal e arritmias 8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca 2+ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca 2+ níveis11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao Ca2 + inactivação dependente 12. Assim, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é um regulador "ativo" da função contrátil intracelular de Ca2 + homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca 2+ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca.Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca 2+, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.
Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares de Ca2 + transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionai…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013068067); pelo Programa de Pós-Graduação Cérebro Korea 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, Hospital da Universidade Nacional de Seul, a sociedade coreana de Hipertensão (2013), SK Fund Research Telecom coreano (no. 3420130290) e da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 31460265; 81260035 NSFC).
Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
NaCl | Sigma | S9625 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
MgSO4 | Sigma | M5921 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
Protease | Sigma | P6911 | |
Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
MyoCam-S Power | IonOptix | ||
Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
CFA300 | |||
PMT400 | |||
Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
Compositions of Experimental Solutions | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
Collangenase Solution 1 | |||
Isolation Solution (30mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
Collangenase Solution 2 | |||
Isolation Solution (20mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
BSA solution | |||
Isolation Solution (40mL) | |||
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |