Evaluación de los miofilamentos Ca²⁺ Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

La insuficiencia cardíaca y arritmias cardíacas son las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Sin embargo, el mecanismo de la patogénesis y el mal funcionamiento del miocardio en el corazón enfermo aún no ha sido aclarado. Evidencia convincente reciente demuestra que los cambios en la sensibilidad a la myofilament Ca ²⁺ afectan Ca intracelular ²⁺ actividades homeostasis y de los canales iónicos en los miocitos cardiacos, los mecanismos esenciales responsables de potencial de acción cardíaco y la contracción en corazones sanos y enfermos. De hecho, las actividades de los canales iónicos y transportadores subyacentes potenciales de acción cardiacos (por ejemplo, Na ^+, Ca2 ⁺ y canales de K ⁺ y el intercambiador de Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ y Ca ^{2 +} manejo proteínas intracelulares (por ejemplo., Receptores de rianodina y Ca ^{2 +} -ATPasa en retículo sarcoplásmico (SERCA2a) o fosfolamban y su fosforilación) se miden convencionalmente para Evalucomieron los mecanismos fundamentales de acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE). Ambas actividades eléctricas en la membrana y cambios intracelulares de Ca ²⁺ son las señales de disparo de acoplamiento CE, mientras que los miofilamentos es la unidad funcional de la contracción y la relajación, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ es imprescindible en la aplicación de los resultados de las miofibrillas. Sin embargo, pocos estudios incorporan sensibilidad myofilament Ca ²⁺ en el análisis funcional del miocardio a menos que sea el foco del estudio. A continuación, se describe un protocolo que mide el acortamiento del sarcómero / re-alargamiento y el nivel intracelular ^de Ca2 ⁺ con Fura-2 de AM (detección radiométrica) y evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos de corazones de ratas. El objetivo principal es hacer hincapié en que myofilament Ca ^{2 +} sensibilidad debe ser tomado en consideración en el acoplamiento CE para el análisis mecanicista. investigación exhaustiva de ien los canales iónicos, transportadores, manejo intracelular ^de Ca2 ^+, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ que subyacen en la contractilidad de los miocitos en corazones sanos y enfermos proporcionará información valiosa para el diseño de estrategias más eficaces de traslación y de valor terapéutico.

Introduction

Acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE) es el esquema fundamental para el análisis de las propiedades mecánicas del miocardio, es decir, la función contráctil del corazón ^1,2. Acoplamiento CE se inicia por despolarización de la membrana secundaria a las actividades de los canales de iones sarcolema (por ejemplo, el canal de Na ⁺ dependiente de voltaje, que se puede medir a través de técnicas de patch-clamp). La posterior activación de voltaje de tipo L de Ca ^{2 +} canales (LTCCs) y Ca ^{2 +} afluencia través LTCCs desencadenar la mayor parte de la liberación ^de Ca2 ⁺ a través de receptores de rianodina (RyRs), el aumento de la concentración citosólica ^de Ca2 ⁺ desde el nanomolar (nM ) a nivel micromolar (M). Este aumento en Ca ²⁺ citosólico promueve Ca ²⁺ unión a la troponina C (TnC) en filamentos delgados y provoca cambios conformacionales del complejo de filamentos para facilitar la interacción actina-miosina y alcanza myocardiAl contracción del ^3. Por el contrario, la citosólica de Ca ²⁺ se re-especialmente captado de nuevo en el retículo sarcoplásmico (SR) a través de la Ca2 ⁺ -ATPasa en SR (SERCA2a) o se extruye fuera de la miocitos a través del intercambiador Na ^{+ 2 +} / Ca y el plasmalemmal Ca ^{2 +} ATPasa ^1,2. En consecuencia, la disminución de Ca ²⁺ citosólico instiga a cambios conformacionales de filamentos delgados de nuevo a su estado original, lo que resulta en la disociación de actina-miosina y la relajación de los miocitos ^1-3. En este esquema, la actividad de la SERCA2a se considera generalmente para determinar la velocidad de relajación del miocardio, ya que representa el 70 – 90% de eliminación citosólica ^de Ca2 ⁺ en la mayoría de las células del corazón de mamífero ^1. Como tal, la manipulación anormal ^de Ca2 ⁺ por LTCC, RyR y SERCA2a, etc. ha sido considerado como los principales mecanismos de deterioro de la contractilidad y la relajación en el corazón enfermo ^1-4.

<p class="jove_content"> En realidad, citosólica de Ca ²⁺ libre que funciona como el mensajero en cuentas de acoplamiento de la CE de alrededor del 1% del total de Ca ²⁺ intracelular y la mayoría de Ca2 ⁺ está obligado a Ca2 ⁺ intracelular tampones ^5,6. Esto es debido al hecho de que varios ^de Ca ^{2 +} tampones son abundantes en los miocitos cardíacos, por ejemplo, los fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbúmina, miofibrilla TnC, miosina, SERCA2a, y calsecuestrina en la SR. ^5,6,7. Entre ellos, la SERCA2a y TNC son los predominantes Ca ²⁺ tampones ^5,6,7. Además, Ca ^{2 +} vinculante a sus buffers es un proceso dinámico durante contracción (por ejemplo, 30-50% de Ca ^{2 +} se une a TnC y se disocian de ella durante Ca ^{2 +} transitorios ⁷⁾ y el cambio en el Ca ²⁺ causa adicional de unión "liberar" de Ca2 ⁺ libre en el citosol, los resultados en las alteraciones del Ca2 ⁺ intracelular concentration. En consecuencia, la perturbación del nivel intracelular de Ca2 ⁺ induce movimientos anormales myofilament, que son los precursores de la disfunción contráctil y arritmias ^8,9. Muchos factores (tanto fisiológicas como patológicas) pueden ser las fuentes de modificaciones post-transcripcional de proteínas myofilament, que influyen en myofilament Ca ²⁺ búfer y myofilament Ca ^{2 +} sensibilidad ^8-10. Recientemente, se informó de que las mutaciones en las proteínas myofilament aumentan el Ca2 ⁺ intracelular y la afinidad de unión de manipulación ^de Ca2 ^+, lo que provocó la potenciación dependiente de pausa de Ca ^{2 +} transitorios, la liberación anormal ^de Ca2 ^+, y arritmias ^8. De acuerdo con este concepto, también hemos demostrado que los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ desensibilización en corazones de ratas con hipertensión secundaria a la regulación de la óxido nítrico sintasa neuronal se asocia con diastólica elevada y sistólica niveles ^{de Ca2 +11,} que a su vez, aumenta la vulnerabilidad de la LTCC a Ca ^{2 +} -dependiente de inactivación ^12. Por lo tanto, la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ es un regulador "activa" de la homeostasis intracelular y la función contráctil de los miocitos Ca ^2+. Se ha hecho necesario para analizar las interacciones entre los miofilamentos y Ca ²⁺ manejo de proteínas para la investigación a fondo de los miocitos CE acoplamiento y la función cardiaca.

A continuación, se describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos aislados. Análisis exhaustivo de perfil intracelular ^de Ca2 ^+, la sensibilidad y la contracción de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ se desvela los nuevos mecanismos de la mecánica miocárdica subyacente.

Protocol

El protocolo está de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de la ONU (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996). Fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación del IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Preparación de búfer (Materiales y Equipo de mesa) Preparar 300 ml de solución de aislamiento fresco en el día del experi…

Representative Results

miocitos LV están aisladas de corazones normales e hipertensos de rata. Miocitos en forma de varilla con estrías claros (que representa sarcómeros) y contracciones estables en respuesta a la estimulación de campo se consideran ser los miocitos óptimas y se seleccionan para las grabaciones (Figura 2A). En el ejemplo mostrado en la FIGURA 2A, un Fura 2 a.m. RESORTE LV miocitos se coloca horizontalmente y la abertura de la cámara se ajusta para que el…

Discussion

A continuación, describimos los protocolos para evaluar los cambios de la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos aislados única y hacemos hincapié en la importancia de medir este parámetro junto con las propiedades electrofisiológicas, intracelular de Ca ^{2 +} transitorios, y la dinámica de los miofilamentos. Esto se debe a las grabaciones de uno o dos de los parámetros no pueden explicar los mecanismos subyacentes de la contracción cardíaca y la rel…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM