Vurdering af Myofilament Ca²⁺ Følsomhed Underliggende Cardiac Excitation-sammentrækning Kobling

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

Hjertesvigt og hjertearytmi er de førende årsager til dødelighed og sygelighed i hele verden. Men stadig den mekanisme af patogenese og myokardie funktionsfejl i det syge hjerte, at være fuldt afklaret. Seneste overbevisende dokumentation viser, at ændringer i myofilament Ca2 ⁺ følsomhed påvirker intracellulær Ca2 ⁺ homeostase og ionkanal-aktiviteter i hjertemyocytter, de væsentlige mekanismer ansvarlige for hjertets handling potentiale og sammentrækning i raske og syge hjerter. Faktisk aktiviteter af ionkanaler og transportere underliggende hjerte- aktionspotentialer (f.eks Na ^+, Ca ²⁺ og K ⁺ kanaler og Na ⁺ -CA ²⁺ veksler) og intracellulære Ca ²⁺ håndtering proteiner (f.eks., Ryanodine receptorer og Ca ²⁺ -ATPase i reticulum (SERCA2a) eller phospholamban og dets phosphorylering) konventionelt måles til vurspiste de fundamentale mekanismer i hjerte-excitation-kontraktion (EF) kobling. Begge elektriske aktiviteter i membranen og intracellulære Ca ²⁺ ændringer er trigger signaler af EF-kobling, mens myofilament er den funktionelle enhed af sammentrækning og afslapning, og myofilament Ca2 ⁺ følsomhed er afgørende for gennemførelsen af myofibrillære ydeevne. Ikke desto mindre, få studier indarbejde myofilament Ca2 ⁺ følsomhed til den funktionelle analyse af myokardiet, medmindre det er i fokus for undersøgelsen. Her beskriver vi en protokol, der måler sarkomer afkortning / re-forlængelse og intracellulær Ca2 ⁺ niveau ved hjælp Fura-2 AM (ratiometrisk påvisning) og vurderingen af ændringer af myofilament Ca2 ⁺ følsomhed i hjertemyocytter fra rottehjerter. Hovedformålet er at understrege, at myofilament bør tages Ca2 ⁺ følsomhed i betragtning i EF-kobling til mekanistisk analyse. Omfattende undersøgelse af ipå kanaler, ion transportører, intracellulær Ca2 ⁺ håndtering og myofilament Ca2 ⁺ følsomhed, der ligger til grund for myocyt kontraktilitet hos raske og syge hjerter vil give værdifulde oplysninger til at designe mere effektive strategier for translationel og terapeutisk værdi.

Introduction

Cardiac excitation-kontraktion (EF) kobling er den grundlæggende ordning til analyse mekaniske egenskaber af myocardium, dvs, den kontraktile funktion af hjertet ^1,2. EF-kobling er initieret af membran depolarisering sekundært til aktiviteter sarcolemmal ionkanaler (f.eks spændingen-gatede Na ⁺ kanal, som kan måles via patch-clamp-teknikker). Efterfølgende aktivering af spændingsstyrede L-typen Ca2 ⁺ kanaler (LTCCs) og Ca2 ⁺ tilstrømning via LTCCs udløse størstedelen af Ca ²⁺ frigivelse gennem ryanodine receptorer (RyRs), forøgelse af cytosoliske Ca2 ⁺ -koncentration fra det nanomolære (nM ) til mikromolær (uM) niveau. En sådan forøgelse i cytosolisk Ca2 ⁺ fremmer Ca2 ⁺ binding til troponin C (TNC) i tynde filamenter og fremkalder konformationelle ændringer af filamentet komplekset for at lette actin-myosin interaktion og opnår myocardial sammentrækning ^3. Omvendt er den cytosoliske Ca2 ⁺ er re-uptaken tilbage i reticulum (SR) gennem Ca2 ⁺ -ATPase i SR (SERCA2a) eller ekstruderes ud af myocyt via Na ⁺ / Ca2 ⁺ veksler og plasmalemmal Ca2 ⁺ ATPase ^1,2. Følgelig faldet i cytosoliske Ca2 ⁺ ansporer konformationsændringer af tynde filamenter tilbage til den oprindelige tilstand, hvilket resulterer i dissociation af actin-myosin og myocyt afslapning ^1-3. I dette skema er aktiviteten af SERCA2a almindelighed for at bestemme hastigheden af myocardial afslapning fordi den udgør 70 – 90% af cytosolisk Ca2 ⁺ fjernelse i de fleste mammale hjerteceller ^1. Som sådan, unormal Ca ²⁺ håndtering af LTCC, RyR og SERCA2a mv har været betragtet de primære mekanismer for svækket kontraktilitet og afslapning i det syge hjerte ^1-4.

<p class="jove_content"> I virkeligheden gratis cytosolisk Ca2 ^+, der fungerer som budbringer i EF-kobling udgør omkring 1% af den samlede intracellulær Ca2 ⁺ og størstedelen af Ca ²⁺ er bundet til intracellulære Ca ²⁺ buffere ^5,6. Dette skyldes det faktum, at forskellige Ca2 ⁺ buffere er rigelige i hjertemyocytter, f.eks membranphospholipider ATP, phosphocreatin, calmodulin, parvalbumin, myofibrillære TNC, myosin, SERCA2a, og calsequestrin i SR. ^5,6,7. Blandt dem, SERCA2a og TNC er de fremherskende Ca2 ⁺ buffere ^5,6,7. Endvidere Ca2 ⁺ binding til dens buffere er en dynamisk proces under spjæt (f.eks 30-50% af Ca2 ⁺ bindes til TNC og dissociere fra det under Ca2 ⁺ transienter ⁷⁾ og ændringen i Ca2 ⁺ binding forårsage yderligere "frigive" frie Ca2 ⁺ til cytosolen, resulterer i ændringer af intracellulær Ca2 ⁺ koncentration. Derfor forstyrrelse af intracellulære Ca2 ⁺ niveau inducerer unormale myofilament bevægelser, som er forløberne for kontraktile dysfunktion og arytmier ^8,9. Mange faktorer (både fysiologiske og patologiske) kan være kilderne til post-transcriptionale modifikationer af myofilament proteiner, som påvirker myofilament Ca2 ⁺ buffering og myofilament Ca2 ⁺ følsomhed ^8-10. For nylig blev det rapporteret, at mutationer i myofilament proteiner øger Ca2 ⁺ bindingsaffinitet og intracellulær Ca2 ⁺ håndtering, udløser pause-afhængig potensering af Ca2 ⁺ transienter, unormal Ca2 ⁺ frigivelse, og arytmier ^8. I overensstemmelse med dette koncept har vi også vist, at myofilament Ca2 ⁺ desensibilisering i hypertensive rottehjerter sekundært til opreguleringen af neuronal nitrogenoxidsyntase er forbundet med forhøjet diastolisk og systolisk Ca2 ⁺ niveauer^11, hvilket igen øger sårbarheden af LTCC til Ca ^{2 +} -afhængig inaktivering ^12. Derfor myofilament Ca2 ⁺ følsomhed er en "aktiv" regulator af intracellulær Ca2 ⁺ homøostase og myocyt kontraktile funktion. Det er blevet nødvendigt at analysere samspillet mellem myofilament og Ca ²⁺ håndtering proteiner til grundig undersøgelse af myocyt EF kobling og hjertefunktion.

Her beskriver vi en protokol, der vurderer ændringerne i myofilament Ca2 ⁺ følsomhed i isolerede hjertemyocytter. Omfattende analyse af intracellulær Ca2 ⁺ profil, vil myofilament Ca2 ⁺ følsomhed og sammentrækning grave nye mekanismer underliggende myokardiale mekanik.

Protocol

Protokollen er i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er offentliggjort af FN National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, revideret 1996). Den blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Seoul National University (IACUC godkendelse nr .: SNU-101.213 til 1). 1. Buffer Forberedelse (tabel Materialer og udstyr) Forbered 300 ml frisk isolation opløsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl, 135; KCl, 5…

Representative Results

LV myocytter isoleres fra normale og hypertensive rottehjerter. Stavformede myocytter med klare striber (som repræsenterer sarkomerer) og stabile sammentrækninger i respons på marken stimulering anses for at være de optimale myocytter og udvælges til optagelser (figur 2A). I den i F igur 2A eksempel en Fura 02:00 -loaded LV myocyt står vandret, og åbningen af kameraet er indstillet således, at myocyt optager det meste af optagelsen felt og minima…

Discussion

Her beskriver vi de protokoller, til at vurdere ændringer i myofilament Ca2 ⁺ følsomhed i enkelt isoleret hjertemyocyt og understrege vigtigheden af at måle denne parameter sammen elektrofysiologiske egenskaber, intracellulære Ca ^{2 +} transienter, og myofilament dynamik. Dette skyldes, at optagelser af en eller to af de parametre, der ikke kan explicate mekanismerne bag hjerte- sammentrækning og afslapning. I modsætning til konventionelle metoder, der måler myocyt sammentrækning og intracell…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM