Introduction
Een recent ontwikkelde high-throughput assay eencellige techniek maakt nieuwe enzymen te screenen van een grote bibliotheek genetische basis van hun functionele activiteiten 1. Bij de enkele cel niveau worden eiwitten die transcriptie gebruikt voor reportergenexpressie te activeren door het aftasten van kleine moleculen die worden geproduceerd als gevolg van een doel enzymactiviteit. Een eerste benadering betrof de isolatie van een fenol-afbrekende operon van Ralstonia eutropha E2 met de substraat-geïnduceerde genetische expressiescreenen (SIGEX) methode, waarbij het substraat induceert de expressie van een reporter proteïne 2. Nhar van Pseudomonas putida werd gebruikt om benzaldehyde dehydrogenase 3 selecteren en LysG van Corynebacterium glutamicum werd gebruikt voor high-throughput screening van een nieuwe-L-lysine producerende stam van diverse mutante bibliotheken 4.
Voorheen, een genetische enzym screening systeem (GESS) werd voorgesteld als een algemeen geldend screening platform 5. Dit systeem maakt gebruik van de met fenol herkennen dimethylfenol regulator DMPr, P. putida. DMPr (E135K) en een mutant van DMPr, kan ook worden toegepast in GESS (pNP-GESS) voor de detectie van p-nitrofenol (pNP). In aanwezigheid van het doel enzymen produceren fenolverbindingen, GESS in E. coli-cellen geeft een fluorescentiesignaal, zodat de snelle isolatie van afzonderlijke cellen met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Maar de expressie van metagenomic enzym lijkt zwakker dan die van conventionele recombinant-enzymen; Daarom GESS ontworpen om fenolverbindingen met maximale gevoeligheid gedetecteerd door het onderzoeken van de combinatie van ribosomale bindingsplaats (RBS) en terminatorsequenties met optimale bedrijfstoestand 5.
Een van de fundamentele voordelen van GESS is dat deze enkele methode theorie maakt de screening van over dan 200 verschillende typen enzymen in de BRENDA gegevensbank (Tabel 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) door eenvoudigweg gebruik verschillende substraten. Er werd aangetoond dat cellulase, lipase en methyl parathion hydrolase (MPH) kunnen worden gedetecteerd onder toepassing pNP-GESS met geschikt substraat p-nitrofenyl butyraat, p-nitrofenyl cellotrioside en methyl parathion respectievelijk 5. Recent werd aangetoond dat een alkalische fosfatase (AP), die één van de nieuwe enzymen geïdentificeerd middels pNP-GESS, is de eerste thermolabiele AP in koude aangepast marine metagenomes 6.
Hier, details van de screening wordt gepresenteerd pNP-GESS detecteren van de activiteiten van drie verschillende soorten enzymes- lipase, cellulase, en alkalische fosfatase; en snel vast kandidaatcomponenten enzymen uit een bibliotheek metagenomic 5,6. De werkwijzen omvatten metagenoom voorbewerking met PNP GESS en de exploitatie van een flow cytometrie sorter. Terwijl het verkregen treffers moeten worden gesequenced voor verdere identificatie Dit protocol omvat de procedure bij het trapje enzym bevestiging activiteit met flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Metagenomic Bibliotheek met PNP GESS
- De bouw van een metagenomic bibliotheek in E. coli met gebruikmaking van een vector fosmid fosmid bibliotheek productie kit volgens de fabrikant protocol 5.
- Aliquot 100 ul van de bibliotheek voor opslag bij -70 ° C, hetgeen een bron van metagenomic bibliotheek cellen.
Opmerking: De optische dichtheid van een monster gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD 600) van deze bibliotheek stock ongeveer 100. - Ontdooien 100 pl van de stock metagenomic bibliotheek op ijs en beënt in een kolf van 500 ml bevattende 50 ml Luria-Bertani (LB) en 12,5 ug / ml chlooramfenicol gevolgd door 37 ° C incubatie gedurende 2 uur.
- Oogst de cellen in een 50 ml conische buis door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet snel in 50 ml ijskoud gedestilleerd water (DW) en gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C weer.
- Resuspend de pellet in 50 ul ijskoude DW met 10% (v / v) glycerol. Gebruik 50 gl van deze cel aliquot voor elektroporatie.
- Plaats het mengsel van elektrocompetente cellen 50 pl en pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in een ijskoude elektroporatie cuvette en electroporate (1,8 kV / cm, 25 uF) het mengsel.
- Snel voeg 1 ml super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium en resuspendeer de cellen voorzichtig.
- Breng de cellen in 14 ml ronde bodem buis met behulp van een pipet en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Spread 500 ul van de cellen teruggewonnen op een LB 20 x 20 cm vierkante plaat met 12,5 ug / ml chloramfenicol en 50 ug / ml ampicilline. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 12 uur.
- Schraap de kolonies met behulp van een cel schraper en het verzamelen van de cellen in een 50 ml conische buis met behulp van ijskoude cel opslagmedia.
- Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude cel opslagmediaom een OD 600 te bereiken van 100.
- Aliquot 20 ul van de cellen voor opslag bij -70 ° C.
2. Het verwijderen van valse meldingen van de Metagenomic Library
- Ontdooi de voorraad metagenomic bibliotheek cellen (vanaf stap 1,13) dat metagenomic DNA fosmid en pGESS (E135K) op ijs.
- Inoculeer 10 ul van de cellen in 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol in een 14-ml ronde bodem buis. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm gedurende 4 uur.
- Ondertussen zet de FACS machine en open de standaard FACS software. Gebruik de volgende instellingen: nozzle tip diameter, 70 micrometer; Forward Scatter Area (FSC-A) gevoeligheid, 300 V-logaritmische versterking; Side Scatter Area (SSC-A) gevoeligheid, 350 V-logaritmische versterking; Fluoresceïneisothiocyanaat Area (FITC-A) gevoeligheid, 450 V-logaritmische versterking; drempel parameter, FSC-A waarde 5.
Opmerking: Typisch instellingen worden gegevenvoor FACS in de tabel van Materialen genoemd apparaat. Pas de instellingen voor andere FACS apparaten. - Verdun het metagenomic bibliotheek cellen uit stap 2.2 door toevoeging van 5 ul van het monster op een 5-ml ronde bodem buis met 1 ml PBS.
- Leg het verdunde bibliotheek monster op de laad-poort van de FACS instrument en klik op de knop Load op de Overname Dashboard van de FACS software.
- Pas de incidentie tot 1.000 - 1.500 evenementen / sec door te klikken en regelen van het debiet knoppen op het dashboard.
- Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald SSC-A scatter plot op een wereldwijde werkblad door te klikken op de Dot Plot-knop in de werkbalk. Pas de scatter poort R1 aan de singlet evenementen (bacteriële populatie) met de Polygon Gate knop in de werkbalk te omvatten.
- Plot een histogram met celgetal vs. log geschaald FITC-A op het werkblad door te klikken op de knop Histogram. Dan pas de FITC spanning van de Cytometab ter instellingen op het infovenster controle zodanig dat de piek van de klokvormige verdeling kleiner dan 10 2 van FITC-A.
- Maak een log geschaald FSC-A vs. de log-FITC Een perceel door te klikken op de Dot Plot-knop op de wereldwijde werkblad. Stel een sortering poort R2 op perceel via de veelhoek Gate knop op de werkbalk zodat de poort zich tussen + 5% en -5% van de cellen van het centrum van de verdeling (totaal 10% cellen rond de piek van de bell- vormige curve).
- Plaats een verzamelbuis met 1,2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 6 cellen die zowel aan de R1 en R2 poorten.
- Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex.
3. Metagenomic Enzyme Screening
- Incubeer de gesorteerde cellen (uit stap 2,11) bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de OD600 0,5 bereikt.
- Voeg 1 ui kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
- Cellen voorbereiden voor het sorteren, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen en een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, p-nitrofenyl-β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) in een 14 ml rondbodem buis bij een eindconcentratie van 100 uM.
- Een controlemonster, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen uit stap 3.2 in een 14-ml ronde bodem buis. Voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 3,3.
- Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur.
- Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als stap 2.3.
- Voeg 5 ul van de cellen (voor het sorteren) en controlecellen twee 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk.
- Plaats de buis met controlecellen op thij het laden haven van de FACS en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Stel de gebeurtenis Rate 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het beheersen van Flow Rate knoppen op het dashboard.
- Maak log schaal FSC-A versus log schaal SSC-A scatterplot op de pagina puntenplot knop op de globale werkblad van de software en stel de spreiding poort R1 de singlet gebeurtenissen omvatten (bacteriepopulatie) via de veelhoek Gate knop op de werkbalk.
- Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald FITC-A scatterplot door te klikken op de Dot Plot-knop op het werkblad en stel een sortering poort R2 op het perceel met de Polygon Gate knop op de werkbalk, zodat er minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd binnen de R2 gate.
- Vervang de monsterbus met de sortering monsterbuis en stel de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het regelen van het debiet knoppen op het dashboard.
- Leg een verzameling buis met 0,5ml LB bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 4 cellen die voldoen aan zowel de R1 en R2 poorten.
Opmerking: De sorteercriterium kan van boven 0,1% tot 5% van FITC-A variëren in de R2 gate. In dit protocol werden de top 1% van de cellen verzameld als positieven. - Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex.
- Spreid de 0,5 ml verzamelde monsters op twee agarplaten (90 mm petrischalen) bevattende LB, 50 ug / ml ampicilline, 12,5 ug / ml chlooramfenicol en incubeer de plaat bij 37 ° C overnacht.
- Voer zo nodig extra ronden van het sorteren voor FITC-A verrijking door het herhalen van Steps 3,1-3,14.
4. Hit Selection en enzymactiviteit Bevestiging
- Flowcytometrieanalyse
- Uit de bebroede plaat bij stap 3.14, selecteer een kolonie toont geen fluorescentie met behulp van een kolonie picker onder de observatie van 488 nm golflengte van een LED-verlichting.
- Inoculeer de geselecteerde kolonie in een 14-ml ro-und bodem buis met 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de OD600 0,5 bereikt.
- Voeg 2 pl kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
- Bereid een 14 ml rondbodem buis en voeg 1 ml van de gekweekte cellen (stap 4.1.3). Voeg een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, blz -nitrophenyl- β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) bij een uiteindelijke concentratie van 100 uM.
- Voor een controle, voeg 1 ml gekweekte cellen uit stap 4.1.3 in een 14 ml rondbodem buis en voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 4.1.4.
- Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur.
- Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als Step 2.3.
- Voeg 5 ul van de controle- en behandelde substraat cellen 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk.
- Plaats de buis met controle cellen op de laadhaven van de FACS apparaat en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard.
- Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A.
- Vervang de monsterbus met het substraat behandelde monster buis. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard.
- Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A.
- Vergelijk de fluorescentie van beide groepen van cellen door het uitzetten van een histogram van het aantal cellen versus de log schaal FITC-A.
- Andere assays voor enzymactiviteit bevestigen
- Voor verdere identificatie van de geselecteerde kandidaten enzym, extraheren fosmid DNA met behulp van standaard-extractie proprocedures van het commerciële kits extractie en analyse van de nucleotidesequentie of de in vitro enzymactiviteit 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De drie fenolische substraten werden onderzocht om nieuwe metagenomic enzymen uit een metagenoom bibliotheek van de oceaan-tidal flat sedimenten in Taean, Zuid-Korea te identificeren aan de hand van de voorgestelde protocol. Voor de bankconstructie, gemiddeld 30 - 40 kb werden metagenoom sequenties ingevoegd in fosmids, die zijn gebaseerd op de E. coli F factor replicon en gepresenteerd als een enkel exemplaar in een cel. Merk op dat fosmids zijn op grote schaal gebruikt voor het construeren van complexe genomische bibliotheken door hun stabiele propagatie 8.
Figuur 1 toont een stroomdiagram van de korte screeningsprotocol inbegrip van het verwijderen van valse positieven met negatieve sortering (figuur 1 A), gevolgd door positieve selectie met hit R1 en R2 sortering poorten (figuur 1 B). Hits werden beoordeeld door vergelijking van de fluorescentie van de monsters met en zonder substraten(Figuur 1 C). Bij p-nitrofenyl acetaat gemedieerde screening werden vijf kandidaten lipase bevestigd wanneer de fluorescentie van substraat behandelde cellen hoger dan die van controlecellen (figuur 2 A) waren. Ondanks de brede verdelingen van de drie kandidaten cellulase in figuur 2 B, toonden zij ook duidelijke verschillen in gemiddelde FITC intensiteit van de populaties. Vier fosfatase kandidaten toonde ook een hoog niveau aan fluorescentie in vergelijking met de controlecellen (figuur 2 C). Hoe meer fluorescentie verschil tussen negatieve en de kandidaat cellen sterker enzymactiviteit kan worden afgeleid, omdat de fluorescentie reporter van pNP-GESS toont kwantitatieve reacties op de fenol concentraties 5.
In dit protocol alleen de fluorescentie verschillen bevestigd met een flow cytometrie maar verschillende identificatie assays kunnen worden toegepast eens vermeld in stap 4,2. Figuur 3 toont het voorbeeld van AP identificatie 6. Een geselecteerde kloon onder zevenenveertig sterk fluorescerende kolonies van de screening werd gesequentieerd en een ORF van het kandidaat toegangspunt geïdentificeerd. De ORF geïnsereerd in een plasmide vector werd bevestigd aan AP activiteit flow cytometrie. In figuur 3, toont de hit sterker fluorescentiesignaal dan de cellen die lege plasmide (negatief). Verdere analyse van volgorde en in vitro enzymatische activiteit ontdekt dat AP was zeer vergelijkbaar met andere bekende AP in de enzymatische eigenschappen behalve hoge katalytische activiteit bij lagere temperaturen (35 ° C) en een opmerkelijke thermische instabiliteit (65 ° C) binnen 15 min 6 . Bovendien, de gescreende AP was vergelijkbaar met commercieel beschikbare AP in het verwijderen van terminale fosfaten uit samenhangende en stompe uiteinden van het gelineariseerde plasmide DNA 6.
Figuur 1:. Multi Enzym screening (A) Verwijdering van vals-positieve cellen toont fluorescentie zonder substraat. De sorteerinrichting poort is gelegen in het midden van de dichtheid celpopulatie waardoor de poort bevat 10% van de totale cellen. (B) Sortering hoge fluorescentie (FITC-A) cellen (positieve) voldoen R1 en R2 poorten in aanwezigheid van een geschikt substraat. (C) Na de selectie en isolatie cel, de activiteit van de kandidaat-enzymen werd onderzocht met en zonder het substraat (aangeduid als W / en W / O substraten, respectievelijk). De duidelijk signaal verschil tussen de twee monsters impliceert fosmid vector van de cellen bevat doelwit genetische informatie van belang zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: enzymactiviteit Evaluatie behulp van flowcytometrie Metagenomic enzym kandidaten gescreend door pNP-GESS met drie verschillende substraten (A) p-nitrofenyl acetaat (pNPA), (B) p-nitrofenyl-β-D-cellobioside (pNPG2) en. (C) fenylfosfaat. Alle kandidaten tonen duidelijk signaal verschil tussen cellen met en zonder substraat. De controles zijn de cellen zonder de bijbehorende substraat behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: alkalische fosfatase Identification. Linker paneel toont duidelijk fluorescentie verschil tussen de cellen die het enzym geraakt en een lege plasmidevector (negatief). Rechts is fosfatase assay van cellen die de fosfatase kandidaatgen in een plasmidevector op LB agar dat 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat als een colorimetrisch substraat weergegeven. Blauwe kolonies geven aan dat de geselecteerde cellen bevatten metagenomic gen dat codeert voor een fosfatase. Zie 6 voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| EG-nummer | Beschrijving | Aantal p-nitrofenol producerende enzymen | Aantal fenol producerende enzymen | |
| EC 1 </ Td> | 1.3 | Die op de CH-CH groep donoren | - | 1 |
| oxidoreductasen | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Werkend op gepaarde donoren, met al of niet | - | 2 | |
| reductie van moleculaire zuurstof | ||||
| EG 2 | 2.3 | acyltransferasen | 1 | - |
| transferasen | 2.4 | glycosyltransferasen | 8 | - |
| 2.5 | Overdragen alkyl- of arylgroepen, anders dan methylgroepen | 1 | 1 | |
| 2.7 | Overdracht fosforbevattende groepen | 1 | 1 | |
| 2.8 | Overdracht zwavelbevattende groepen | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | Wet op de esterbindingen | 67 | 16 |
| hydrolasen | 3.2 | glycosylases | 75 | 21 |
| 3.4 | Wet op de peptidebindingen - peptidase | 26 | 4 | |
| 3.5 | Wet op koolstof-stikstof bindingen, anders dan peptidebindingen | 5 | 3 | |
| 3.6 | Wet op de zuuranhydriden | 4 | - | |
| 3.7 | Wet op koolstof-koolstofbindingen | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | Koolstof-koolstof lyasen | - | 3 |
| lyasen | 4.2 | Koolstof-zuurstof lyasen | 1 | - |
| 4.3 | Koolstof-stikstof lyasen | 1 | - | |
| Subtotaal aantal enzymen | 197 | 53 | ||
| Totaal aantal enzymen (exclusief overlapt enzymen) | 211 | |||
Tabel 1: Het aantal enzymen dat p-nitrofenol of Fenol Producten uit de BRENDA Database.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verhogen van de productie-efficiëntie van biokatalysatoren is een sleutel voor het succes van de bio-chemische gebaseerde industrie 9 en metagenoom wordt beschouwd als een van de beste natuurlijke enzym bron. In dit opzicht is het essentieel om screening nieuwe enzymen van de metagenoom waarbij meeste genetische middelen niet onderzocht 10. Verschillende screeningswerkwijzen ontwikkeld die direct detecteren enzymproducten via transcriptionele activators 11, 12 maar deze technieken vereisen specifieke metaboliet-responsieve transcriptie systeem. Anderzijds, GESS breed toepasbaar afhankelijk van het gebruik van fenol of pNP hebben substraten. Hoewel de meeste van de gemelde enzymen produceren fenol- of pNP verbindingen BRENDA gegevensbank (Tabel 1), (waaronder de drie voorbeelden in dit werk) behoren tot de hydrolase (EC nummer 3) klasse enzymen, verkennen meer diverse fenolische substraten en zelfs het ontwerpen van een kunstmatige substraat onderwerpen aanrichten enzymactiviteit, als alternatief natuurlijke substraten, aanzienlijk kan de toepasbaarheid van de screening systeem uit te breiden. Het kiezen voor een geschikt fenol of pNP gelabeld substraat is één van de cruciale stappen van pNP-GESS was sinds de membraanpermeabiliteit en cellulaire effect van het substraat aanzienlijk beïnvloeden onderzoeksprotocol. Hier laten we zien dat industrieel belangrijke drie verschillende typen enzymen kunnen worden geïdentificeerd in een high-throughput wijze met het enkele screeningssysteem.
De aanpak van het gebruik van FACS, naast de hoge-doorvoer screening van metagenomic enzymen, kunnen ook worden toegepast in Engineering transcriptiefactoren (TRS) op veranderde TR specificiteit. Een voorbeeld is een onderzoek waarin een AraC variant die mevalonaat plaats van arabinose gedetecteerd werd geïsoleerd met behulp van FACS, en vervolgens gebruikt voor het screenen van cellen die mevalonaat 13. Ook de verandering van de specificiteit van TR's heeft het mogelijk gemaakt voor Further engineering van enzymactiviteit. Auto-gereguleerde TR, PcaU, werd ontworpen om 3,4-dihydroxybenzoaat (34DHB) detecteren en vervolgens toegepast om te screenen op dehydroshikimaat dehydratase enzymen (AsbF) hun maximale activiteit van endogeen omzetten dehydroshikimaat tot 34DHB 14. Het basisconcept van deze studies is vergelijkbaar met dat van pNP-GESS omdat pNP-GESS gebruikt een DMPr variant pNP detecteren en vertoont hoge doorvoersnelheid bij het screenen van een grote genetische bibliotheek. Evenwel specificiteit techniek onbedoelde valse positieven veroorzaken tussen de hits, aangezien het mogelijk is om reporterexpressie door andere inductoren leiden als gevolg van uitgebreid specificiteit. Daarom zou het wenselijk zijn om de orthogonaliteit van TR responding voordat de TR wordt aangebracht. Anderzijds, verhogen van de gevoeligheid en dynamisch bereik van de TR kan compenseren voor verkeerde positieve genereren. Bijvoorbeeld, de gevoeligheid van GESS verbeterd door het inbrengen geoptimaliseerd RBS en terminator lovertschillen in het systeem. False positives van de screening systeem eventueel komen van een storing van de genetische circuit, onbedoelde fenolische chemicaliën activeren van de TR, heterogene celgroei, en gratis verspreiding van fenol of pNP. De negatieve selectieprocessen van Steps 2,1-2,9 werd verwacht dat ze vals positieve cellen vrijgeven van fluorescentie zonder substraat behandeling te verwijderen. Deze valse positieve cellen kan ook worden verminderd door maximaal signaal-ruisverhouding van de genetische circuit. Naast de RBS en terminator techniek, het gebruik van M9-glucose media aanzienlijk verbeterd signaal (7-voudig hoger dan LB media) in pNP-GESS 5 prestaties. Maar in dit protocol, LB werd gebruikt als een compromis tussen de onbekende metagenomic genexpressie en GESS signaalintensiteit. Onderzoeken van meer delicate omstandigheden PNP-GESS celgroei en substraat effect in M9-glucose in staat stelt om de intensiteit van het signaal te verbeteren. Strakke regulering van de reactietijd van de substraten, in stap 3,5, isOok belangrijk om valse positieven veroorzaakt door fenol of pNP diffusie te voorkomen.
GESS maakt de omzetting van enzym functie in transcriptie gemedieerde reporter eiwit expressie in een single-cell niveau, maar de indirecte identificatie via reporter eiwit zou een van de aangeboren beperkingen. Dus, in vitro enzym-assay en LC / GC-MS analyse van een product moeten worden gevolgd voor definitieve identificatie van een vermoedelijke enzym kandidaat 6,7. Ook is het mogelijk om GESS zonder dure FACS analyse door het aanbrengen alternatieve reporters zoals antibioticumresistentie genen of chromogene enzymen met fluorescerende reporters. Voor verdere verbetering van GESS toepassingen is het noodzakelijk een werkwijze enzymactiviteit te karakteriseren en identificeren van de enzymen in een high-throughput wijze vast. Samen met andere high-throughput technologieën, zoals next-generation sequencing, zal GESS een veel gebruikte strategie voor eiwitten en enzy zijnme katalysator techniek in de biologie gebaseerde industrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
