Introduction
Son yıllarda geliştirilmiş olan, yüksek verimli tek hücreli deney tekniği yeni bir enzim işlevsel etkinlikler 1'e göre büyük ölçekli genetik kütüphaneden taranabilir sağlar. tek hücre düzeyinde, transkripsiyon düzenleyici proteinler, bir hedef enzim etkinliğinin bir sonucu olarak üretilen küçük molekülleri algılayarak raportör gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılır. Buna bir yaklaşım, alt-tabaka bir raportör protein 2 ekspresyonunu indükler formül (SIGEX) yöntemini tarama alt-tabaka ile indüklenen gen ekspresyonunu kullanarak, Ralstonia eutropha E2 bir fenol-bozucu operonun izole çıkıyor. Pseudomonas putida NhaR benzaldehid dehidrojenazı 3 seçmek için kullanılır, ve Corynebacterium glutamicum LysG çeşitli mutant kütüphaneler 4 yeni bir L-Lizin üreten soyun yüksek verimli tarama kullanılmıştır.
Daha önce, bir genetik enzim screening sistemi (GESS) bir genel uygulanabilir bir tarama platformu 5 olarak önerilmiştir. Bu sistem P., DmpR fenol-tanıma dimetilfenol regülatör kullanır putida. DmpR (E135K) ve DmpR bir mutant, S. nitrofenolu (PNP) saptanması için gess (PNP-GESS) 'de kullanılabilmektedir. Fenolik bileşikleri üreten hedef enzimlerin varlığında, GESS E. coli hücreleri bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak, tek hücrelerin hızlı izole edebilecek, bir floresan sinyali verir. Ancak metagenomic enzimin ekspresyonu geleneksel rekombinant enzimlerin daha zayıf görünmektedir; Bu nedenle, GESS uygun çalışma durumunda 5 ile birlikte ribozomal bağlanma yeri (RBS) ve terminatör dizileri ve kombinasyonunu araştırırken en fazla hassasiyet fenolik bileşikleri tespit etmek için tasarlanmıştır.
Gess temel avantajlarından biri bu tek yöntem teorik olarak ov taranmasını izin vermesidirBRENDA veritabanında enzimlerin er 200'den fazla farklı türleri (Tablo 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) sadece farklı substratlar kullanılarak. O selülaz lipaz gördü ve metil paration hidrolaz (MPH) p-nitrofenil butirat, p-nitrofenil-cellotrioside ve metil paration, sırasıyla, 5, uygun substratlann PNP-gess kullanılarak tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu PnP-gess kullanılarak tanımlanan yeni enzim biri bir alkalin fosfataz (AP), soğuğa uyarlanmış deniz metagenomes 6'da bulunan ilk termal olarak AP olduğu kanıtlanmıştır.
Burada tarama işleminin detayları PnP-GESS bir metagenomic kütüphane 5,6 arasında yeni aday enzimleri belirlenmesi hızlı enzimleri, lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz, üç farklı türde aktivitelerini tespit -ve sunulmuştur. süreçler metagenome PnP-gess ile önişleme ve bir fl işletim dahilsitometri sıralayıcı ow. Elde edilen isabetleri fazla tanımlama için dizilenmiştir gerekir ise, bu protokol akış sitometrisi kullanılarak enzim aktivitesi onay işlemine prosedürünü kapsamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PnP-gess ile Metagenomic Kütüphane Hazırlama
- E. bir metagenomic kütüphane inşa E. coli, bir Fosmid vektör ile üreticinin protokolüne 5'e göre bir Fosmid kitaplığı üretimi kiti kullanılarak.
- Kısım metagenomic kütüphanesi bir hücre kaynağıdır, -70 ° C'de, önceki depolama için kütüphane 100 ul.
Not: Bu kütüphane stokunun 600 nm (OD 600) arasında bir dalga uzunluğunda ölçülen bir numunenin optik yoğunluğu yaklaşık 100'dür. - Buz üzerinde hazır metagenomic kütüphane 100 ul çözülme ve 50 ml Luria-Bertani (LB) ve 2 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkalandı ve ardından 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 500 ml'lik bir şişe içinde inoküle.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir.
- Yine, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj hızlı pelletini.
- Res% 10 (h / h) gliserol, 50 ul buz soğukluğunda DW pelet uspend. Elektroporasyon için, bu hücre kısım 50 ul kullanın.
- Buz soğukluğundaki bir elektroporasyon küvetine ve elektroporasyona (1.8 kV / cm, 25 mF) karışım elektro uyumlu hücre 50 ul pGESS (E135K) 5 DNA (100ng) karışımı yerleştirin.
- Hızla katabolik baskı (SOC) orta süper optimum suyu 1 ml ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon.
- bir pipet kullanılarak 14 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe hücreleri aktarın ve 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
- 12.5 ug / ml kloramfenikol ve 50 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 20 x 20 cm kare plaka elde edilen hücreler 500 ul yayıldı. 12 saat boyunca 30 ° C'de inkübe plakası.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak koloniler kazıyın ve buz gibi soğuk hücre depolama ortamı kullanarak bir 50 ml konik tüp içine hücreleri toplamak.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. 10 ml buz gibi soğuk hücre depolama ortamı pelletiniBir OD 100 600 ulaşmak için.
- Kısım -70 ° C'de depolama için hücreler 20 ul.
2. Metagenomic Kitaplığı'ndan Yanlış Pozitif Çıkarma
- buz üzerinde metagenomic DNA fosmid ve pGESS (E135K) içeren (Kademe 1.13 den) stok metagenomic kütüphane hücreleri çözülme.
- 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 2 ml LB içinde hücre 10 ul inoküle. 4 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Bu arada, FACS makine açmak ve varsayılan FACS yazılımını açın. aşağıdaki ayarları kullanın: meme ucu çapı, 70 um; İleri Yayılım Alanı (FSC-A) duyarlılık, 300 V-logaritmik büyütme; Yan Dağılım Alanı (SSC-A) duyarlılık, 350 V-logaritmik büyütme; Floresein izotiosiyanat Konum (FITC-A) hassasiyeti, 450 V logaritmik amplifikasyonu; eşik parametresi, FSC değeri 5.
Not: Normal ayarlar verilmiştirMalzemelerin Tablo belirtilen FACS cihaz için. Diğer FACS cihazlar için ayarları yapın. - 1 ml PBS ihtiva eden bir 5-ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe örnek 5 ul ekleyerek Aşama 2.2 metagenomic kütüphanesi hücreleri seyreltilir.
- FACS enstrüman yükleme noktası üzerine seyreltilmiş kütüphane örnek yerleştirin ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın.
- tıklayıp gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 1,500 olaylar - 1000 olay hızını ayarlayın.
- Günlük araç çubuğunda Dot Plot butonuna tıklayarak bir küresel çalışma sayfasında SSC-A dağılım arsa ölçekli vs günlüğü oluşturmak FSC-A ölçekli. araç çubuğundaki Poligon Kapısı düğmesini kullanarak tekli olayları (bakteriyel nüfus) kapsayacak şekilde dağılım kapısı R1 ayarlayın.
- Günlük Histogram butonuna basarak çalışma sayfasındaki FITC-A ölçekli vs hücre sayımı ile bir histogram çizilir. Daha sonra, Cytome FITC gerilimini ayarlamakÇan-şekilli dağıtım pik FITC-A 10 daha az 2 olacak şekilde Müfettiş Kontrol penceresinden ter Ayarlar sekmesi.
- Vs bir günlük ölçekli FSC-A oluşturun. Günlük FITC Küresel bir çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak arsa. kapı çan zirve etrafında dağılımının merkezine (toplam% 10 hücrelerinden +% 5 ve% -5 hücreleri arasında yer alır, böylece araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 Set şeklinde eğri).
- 1.2 mi LB FACS aletin çıkışında 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren ve R1 ve R2, kapılar hem tatmin sıralamak 10 6 hücre ihtiva eden bir toplama tüpü yerleştirin.
- toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın.
3. Metagenomic Enzim Eleme
- 600 0,5 ulaşana OD kadar 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de (Kademe 2.11) kriteri hücreleri inkübe edin.
- 1 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 3 saat inkübe hücreleri.
- Nihai konsantrasyonda 14 ml'lik bir yuvarlak tabanlı tüp içine 0.5 kültürlenmiş hücrelerin üzerine ilave edildi ve uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin, sıralama için hücrelerin hazırlanması için 100 uM.
- Kontrol grubu için, 14 ml'lik yuvarlak dipli bir tüp içine Aşama 3.2 kültürlenmiş hücreler 0.5 ml ekleyin. Adım 3.3 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin.
- 3 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de iki örnek inkübe edin.
- Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makineyi hazırlamak.
- sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden iki adet 5 ml'lik yuvarlak tabanlı tüpe (sıralama) hücreleri ve kontrol hücreleri 5 ul ekle.
- Kontrol hücreleri t üzerine içeren tüp yerleştirinO FACS limanını yükleme ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3000 olayları - 1000 olay Hızı ayarlayın.
- Günlük yazılımının küresel çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak ve tekli olayları kapsayacak şekilde (bakteriyel nüfus) dağılım kapısı R1 ayarlamak üzerinde Poligon Kapısı düğmesini kullanarak SSC-A dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli araç çubuğu.
- Günlük araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 çalışma sayfasında Nokta Arsa düğmesini tıklayarak ve set tarafından FITC bir dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli böylece daha az% 0.1 negatif hücrelerin R2 kapısı içinde tespit edilir.
- sıralama örnek tüpü ile kontrol örneği tüpü değiştirin ve 1000 olay hızını ayarlamak - gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3,000 olaylar.
- 0.5 içeren bir toplama tüpü yerleştirinml FACS enstrüman çıkışında LB hem R1 ve R2 kapıları tatmin sıralamak 10 4 hücreleri.
Not: sıralama kriteri R2 kapısı FITC-A'nın üst% 0.1 ile% 5 arasında değişebilir. Bu protokolde, üst% 1 hücreleri pozitif olarak toplanmıştır. - toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın.
- LB, 50 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren agar plakaları, iki (90 mm'lik Petri kaplara) üzerine 0.5 mL toplanan numuneleri yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
- Gerekirse, adımları 3,1-3,14 yineleyerek FITC bir zenginleşme için sıralama ek mermi gerçekleştirin.
4. Hit Seçme ve Enzim Aktivitesi Onay
- Flow sitometri analizi
- Adım 3.14 inkübe plakadan, bir LED aydınlatıcı 488 nm dalga boyundaki gözetiminde bir koloni seçiciyi kullanarak hiçbir floresan gösteren bir koloni seçin.
- 14 mi ro seçilen koloni inoküleund altlı 2 mi LB 600 0.5 ulaşana onun OD kadar 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren içeren tüp.
- 2 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 3 saat inkübe hücreleri.
- 14 ml'lik yuvarlak dipli bir tüp hazırlanır ve kültürlenmiş hücrelerde (Aşama 4.1.3) 1 ml ekleyin. 100 uM'lik bir son konsantrasyonda uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, s -nitrophenyl- β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin.
- Bir kontrol için, bir 14 ml yuvarlak tabanlı tüp içine Adım 4.1.3 den 1 ml kültür hücreleri ekleyin ve Adım 4.1.4 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin.
- 3 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de iki örnek inkübe edin.
- Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makinesi hazırlamak.
- sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüplere kontrolü ve alt-tabaka ile muamele edilmiş hücreler içinde 5 ul ekle.
- FACS cihazın yükleme noktası üzerinde tüp içeren kontrol hücrelerini koyun ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın.
- FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın.
- Alt tabaka tedavi numune tüpü ile kontrol numunesi tüpünü değiştirin. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın.
- FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın.
- Günlük FITC-A ölçekli vs hücre sayımı bir histogram çizerek hücrelerin iki grup floresan karşılaştırın.
- Diğer deneyler, enzim etkinliğini doğrulamak için
- Seçilen enzim adayların daha tanımlaması için, standart ekstraksiyon pro kullanarak fosmid DNA ayıklamakTicari ekstraksiyon kitleri prosedürleri ve nükleotid sekansı analiz veya in vitro enzim aktivitesi 6,7 test edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç fenolik yüzeyler önerilen protokol takip ederek Taean'ın, Güney Kore okyanus gelgit düz çökellerin bir metagenome kütüphanesinden yeni metagenomic enzimleri belirlemek için incelenmiştir. Kütüphane yapımı için ortalama 30-40 kb metagenome dizileri E. dayanmaktadır fosmids içine yerleştirildi E. coli K faktörü replikon ve bir hücrenin tek bir kopya olarak sunulmuştur. Fosmids yaygın nedeniyle sabit bir yayılma 8 karmaşık genomik kütüphaneler oluşturmak için kullanılmış olduğunu not edin.
Şekil 1 negatif sıralama ile yanlış pozitif kaldırılması R1 ve R2 kapıları (Şekil 1 B) sıralama ile pozitif hit seçimi takiben (Şekil 1 A) da dahil olmak üzere tarama protokolü kısa bir akış şemasını göstermektedir. vurur ve yüzeylerde olmadan numunelerin floresan karşılaştırılarak değerlendirildi(Şekil 1 C). Alt-tabaka muamele edilmiş hücrelerin floresans kontrol hücreleri (Şekil 2 A) göre daha fazla olduğu p-nitrofenil asetat dolayımlı tarama durumunda, lipaz beş aday doğrulanmıştır. Şekil 2 B selülaz üç aday geniş dağılımları rağmen, onlar da nüfus ortalama FITC yoğunluğu belirgin farklılıklar göstermiştir. Dört fosfataz adaylar da kontrol hücreleri (Şekil 2 C) ile karşılaştırıldığında yüksek floresan seviyesini göstermiştir. Güçlü enzim aktivitesi PnP-gess floresan muhabiri beri çıkarılabilir olumsuz ve aday hücreler arasında daha fazla floresan farkı fenol konsantrasyonları 5 nicel tepkilerini gösterir.
Bu protokol, tek flüoresan fark sitometri akışı ile teyit edilmiştir, ancak farklı işaretlerle deneyleri, uygulanabilirAdım belirtilen s 4.2. Şekil 3 AP kimlik 6 örneğini göstermektedir. tarama 40-7 derece floresan koloniler arasında seçilen bir klon dizildi ve aday AP bir ORF tespit edilmiştir. bir plasmid vektöre yerleştirilir ORF akış sitometrisi AP etkinliğe sahip olduğu teyit edilmiştir. Şekil 3'te, isabet boş plazmid (negatif) taşıyan hücrelerin daha güçlü floresan sinyalini göstermektedir. Dizisinin ve in vitro enzimatik aktivite daha fazla analizi, bu AP düşük sıcaklıklarda yüksek katalitik aktivite (35 ° C) ve 15 dakika ila 6 olan, önemli bir termal instabilite (65 ° C) hariç enzimatik özelliklerindeki diğer bilinen AP çok benzer olduğunu keşfettik . Buna ek olarak, elenmiş AP doğrusallaştırılmış plazmid DNA 6 yapışkan ve küt uçlar terminal fosfat giderilmesinde piyasada bulunan AP karşılaştırılabilir.
Şekil 1:. Alt-tabaka olmadan floresan gösteren yanlış pozitif hücrelerin çoklu enzim Tarama Proses (a) çıkarılması. Kapı toplam hücrelerin% 10 içerir, böylece ayırma kapısı hücre popülasyonu yoğunluğunun ortasında yer alır. Uygun bir alt-tabakanın mevcudiyetinde, R1 ve R2, kapılar karşılayan (b) yüksek floresan Sıralama (FITC-A) (pozitif) hücreleri. (C) seçimi ve tek bir hücre izolasyonu sonra aday enzimlerin aktivitesi ve tabaka olmadan incelendiğinde (sırasıyla, W olarak belirtilir ve / W / O yüzeyler). İki örnek arasındaki net bir sinyal farkı hücrelerinin Fosmid vektör ilgi hedef genetik bilgiyi içerir anlamına gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Enzim Aktivitesi Değerlendirme Akış Sitometri kullanılarak, üç farklı alt-tabaka (A) p-nitrofenil asetat (pNPA), (B) p-nitrofenil-β-D-selobiosidi (pNPG2) ile PnP-gess ile taranmıştır Metagenomic enzim adayları. (c) fenil fosfattır. Tüm adaylar ile ve substrat olmaksızın hücreler arasındaki net bir sinyal farkı göstermek. Kontroller bunlara karşılık gelen substrat tedavi olmadan hücrelerdir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Alkalen Fosfataz Iters düşer. Sol panel hit enzim ve boş plazmid vektörü (Negatif) içeren hücreler arasındaki net floresan farkı gösterir. Sağ tarafta, bir kolorimetrik alt-tabaka olarak 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat ihtiva eden LB agar üzerine bir plasmid vektörü içinde fosfataz aday gen taşıyan hücrelerin fosfataz tahlili gösterilmiştir. Mavi koloniler seçilir hücreler fosfataz kodlayan metagenomic geni içerdiğini göstermektedir. Daha fazla ayrıntı için 6 Bkz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| EC Numarası | Açıklama | P-nitrofenol üreten enzimlerin No | Fenol üreten enzimlerin No | |
| EC 1 </ Td> | 1.3 | donörlerin CH-CH grubunun üzerine harekete | - | 1 |
| oksidoredüktazlar | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | dahil edilmesi ile, eşleştirilmiş donörlerin üzerine harekete veya | - | 2 | |
| moleküler oksijenin azaltılması | ||||
| EC 2 | 2.3 | açiltransferazlar | 1 | - |
| transferazlar | 2.4 | glıkosıltransferazlar | 8 | - |
| 2.5 | metil grubu dışında aktarma alkil ya da aril grupları, | 1 | 1 | |
| 2.7 | Fosfor-ihtiva eden gruplar aktarma | 1 | 1 | |
| 2.8 | Sülfür ihtiva eden gruplar aktarma | 3 | 1 | |
| AK 3 | 3.1 | ester bağları Yasası | 67 | 16 |
| hidrolazlar | 3.2 | glikosilazlar | 75 | 21 |
| 3.4 | peptid bağları Kanunu - peptidaz | 26 | 4 | |
| 3.5 | peptid bağları dışındaki karbon-azot bağlarının, Yasası | 5 | 3 | |
| 3.6 | asit anhidritler Yasası | 4 | - | |
| 3.7 | karbon-karbon bağları Yasası | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | Karbon-karbon Hazlar | - | 3 |
| Liyazlar | 4.2 | Karbon-oksijen liyazlar | 1 | - |
| 4.3 | Karbon-nitrojen liyazlar | 1 | - | |
| enzimlerin subtotal sayısı | 197 | 53 | ||
| enzimlerin sayısı (çakışan enzimler hariç) | 211 | |||
Tablo 1: Brenda Database p-nitrofenolu veya Fenol üretin Enzimler sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyokatalizörler üretim verimliliğinin arttırılması en doğal enzim kaynaklarından biri olarak kabul edilir sanayi 9 ve metagenome bazlı biyo-kimyasal başarısı için bir anahtardır. Bu anlamda, bu genetik kaynakları çoğunluğu 10 keşfedilmemiş olan metagenome elde edilen yeni enzimler tarama için gereklidir. Çeşitli tarama yöntemleri doğrudan kopyalama etkinleştiricileri 11, 12 kullanılarak enzim ürünlerinin tespit geliştirilmiştir, fakat bu teknikler, belirli metabolit duyarlı transkripsiyon sistemi gerektirir. Öte yandan, GESS fenol veya PNP substratlar etiketli kullanımına bağlı olarak geniş çapta uygulanabilir. BRENDA veritabanında (bu çalışmada üç örnekte de dahil olmak üzere) (Tablo 1), fenol veya pnp bileşikleri üreten bildirilen enzimlerin çoğu hidrolaz ait olsa da (AK numarası 3) sınıf enzimler, daha çeşitli fenolik substratları keşfetmek ve hatta yapay tasarımı alt-tabaka tabi tutularakDoğal substratların alternatifleri, önemli ölçüde tarama sisteminin uygulanabilirliğini genişletmek olabilir gibi, enzim aktivitesini hedef. Uygun bir fenol seçerek veya PnP substratı etiketli tarama protokolü etkileyen önemli substrat zarının geçirgenliğini ve hücresel etkisi beri PnP-GESS uygulamasının önemli adımlardan biri olduğunu unutmayın. Burada, enzimlerin endüstriyel önemi üç farklı tip, tek bir tarama sistemini kullanan bir yüksek verimli bir şekilde tespit edilebileceğini göstermektedir.
FACS kullanılarak yaklaşımı, metagenomic enzimlerin yüksek verimli tarama ek olarak, aynı zamanda değiştirilmiş TR özgüllük için transkripsiyonel düzenleyici (TR'ler) mühendislik uygulanabilir. Bir örnek yerine arabinoz mevalonat tespit bir Ara varyant FACS kullanılarak izole ve daha sonra mevalonat 13 üreten ekran hücrelere istihdam edildiği bir çalışmadır. Ayrıca, TRs'nin özgüllük değiştirilmesi Furth için izin verdienzim aktivitesinin er mühendisliği. Otomatik düzenlenir TR PcaU, 3,4-dihidroksibenzoat (34DHB) tespit etmek için tasarlanmış ve 34DHB 14 endojen dehydroshikimate dönüştürme maksimum etkinliğine dehydroshikimate dehidrataz enzimler (AsbF) taranması için uygulanmıştır. Pnp-GESS PnP tespit etmek için bir DmpR varyantı kullanılır ve geniş çaplı bir genetik kütüphaneden eleme yüksek verimli performans gösterir, bu çalışmalar temel kavram, PNP-gess ile verilene benzer. o genişlemiş özgüllük sonucunda diğer teşvik ediciler tarafından muhabir ifade tetiklemek için mümkün olduğu gibi Ancak, özgüllük mühendisliği, hit arasında istenmeyen yanlış pozitif neden olabilir. Bu nedenle, TR uygulanmadan önce TR yanıt ortogonalite araştırmak için arzu edilir. Öte yandan, duyarlılık ve TR dinamik aralığını artırarak yanlış pozitif nesil telafi olabilir. Örneğin, gess duyarlılığı optimize RBS ve terminatör dizisine sokulmasıyla iyileştirildisisteme referanslarınıza. tarama sisteminin yanlış pozitif muhtemelen genetik devrenin arıza gelen, TR, heterojen hücre büyümesini ve fenol ya da PnP serbest difüzyon aktive istenmeyen fenolik kimyasallar. Adımlar 2.1 negatif seçim süreçleri - 2.9 substrat tedavi olmadan floresan bırakmadan yanlış pozitif hücreleri çıkarmak bekleniyordu. Bu sahte pozitif hücreler genetik devresinin sinyal gürültü oranını en üst düzeye azaltılabilir. RBS ve terminatör mühendisliği, M9-glikoz medya kullanımı ile birlikte önemli ölçüde PnP-GESS performans 5 (LB ortamı daha yüksektir 7 kat) sinyali geliştirilmiş. Ama, bu protokolde, LB bilinmeyen metagenomic gen ifadesi ve GESS sinyal yoğunluğu arasında bir uzlaşma olarak kullanılmıştır. M9-glukoz PnP-GESS hücre büyümesi ve alt tabaka etkisi daha hassas koşullarını araştıran sinyal yoğunluğunu artırmak için olanak sağlar. Aşama 3.5 substratların reaksiyon süresi sıkı regülasyonu, olduğuAyrıca önemli fenol ya da PnP difüzyon tarafından tetiklenen yanlış pozitif önlemek için.
GESS tek hücre düzeyinde transkripsiyon aracılı raportör protein ekspresyonu Enzimin fonksiyonunun dönüşümü sağlar, ancak raportör protein ile dolaylı tanımlama doğuştan gelen kısıtlamalar biri olabilir. Bu nedenle, in vitro enzim tahlili ve ürün LC / GC-MS analizi, varsayılan bir enzim aday 6,7 kesin tanımlanması için takip edilmesi gerekir. Ayrıca antibiyotik direnç genleri veya floresan gazetecilere kromojenik enzimler gibi alternatif muhabir takılarak pahalı FACS analizi için gerek kalmadan gess kullanmak mümkündür. GESS uygulamalarının daha da iyileştirilmesi için, enzim aktivitesinin karakterize edilmesi ve bir yüksek verimli bir şekilde enzimler tespit etmek için bir yöntem geliştirmek gereklidir. Bu tür yeni nesil dizileme gibi diğer yüksek verimlilik teknolojileri ile birlikte, GESS protein ve ENZY için yaygın olarak kullanılan bir strateji olacaktırbiyoloji tabanlı endüstride beni katalizör mühendisliği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
