التصوير حيوي داخلي من العدلات الاشعال عن طريق IL-1β يحركها المروج عن dsRed الفئران مراسل
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الإنسان الدورة الدموية وجندت بسرعة إلى مواقع التهابات. فتيلة هو الحدث الحاسم الذي يعزز وظيفة أكلة العدلات. على الرغم من أن دراسات مستفيضة وقد كشفت وجود وأهمية فتيلة العدلات خلال العدوى والإصابة، يعني من تصور هذه العملية في الجسم الحي كانت غير متوفرة. بروتوكول المقدمة يتيح رصد عملية ديناميكية من العدلات فتيلة في الحيوانات التي تعيش من خلال الجمع بين ثلاث منهجيات: 1) عن dsRed إشارة مراسل – تستخدم كمقياس للفتيلة 2) في الجسم الحي العدلات وسم – تحقيق ذلك عن طريق حقن مضان مترافق مكافحة اللمفاويات مستضد 6G (Ly6G) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) و 3) التصوير متحد البؤر حيوي داخلي. وتشارك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول: التي يسببها oxazolone الماوس التهاب الجلد الأذن، والتخدير المناسب للحيوانات، تكرار الحقن المضادة للLy6G ماب، والسابقention التركيز الانجراف أثناء التصوير. على الرغم من أن لوحظ عدد قليل من القيود، مثل الحد من وقت التصوير المستمر (~ 8 ساعات) في الماوس واحد وتسرب ثيوسيانات-ديكستران فلوريسئين من الأوعية الدموية في حالة التهابات، ويوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا للتصوير حيوي داخلي من السلوك معبي العدلة وظيفة، والتي يمكن بسهولة أن توسعت لفحص الخلايا المناعية الأخرى في نماذج التهاب الماوس.
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة وقصيرة الأجل في الدورة الدموية. كانوا يجندون بسرعة إلى مواقع الإصابة أو الإصابات، حيث أنها تخدم البالعات كما المهنية من خلال الافراج عن الأوكسجين والنيتروجين وسيطة رد الفعل جنبا إلى جنب مع حبيبات تحتوي على الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1. خلال تجنيدهم، العدلات هي "تستعد" من قبل مختلف وكلاء بما في ذلك المنتجات الميكروبية، chemoattractants، والسيتوكينات الالتهابية، مما أدى إلى تعزيز ملحوظ وظيفة بلعمية لدى وصوله إلى موقع الالتهاب 2. وقد تم دراسة آليات فتيلة العدلات على نطاق واسع في المختبر 3،4. ومع ذلك، لم يكن رصد دينامية العملية المجراة يمكن حتى الآن.
في الآونة الأخيرة، أصبح التصوير حيوي داخلي تقنية هامة لتصور وقياس ديناميكية الخلوية من العمليات البيولوجية في الكائنات الحية. Intraviتل التصوير لا يمكن أن يؤديها من خلال التقليدية-فوتون واحد الإثارة المجهر (على سبيل المثال، متحد) أو نهج multiphoton المجهري 5. مع مرور الوقت، وقد تم تحقيق تحسينات كبيرة في هذه التقنية تمكن زيادة دقة وضوح الصورة، وتحسين عمق التصوير، وانخفاض photodamage الأنسجة، وتعزيز 6،7 تثبيت الصورة. ونظرا إلى قدرة فريدة من نوعها لتمكين التصور الدينامي للهجرة الخلوية والتفاعل مع مرور الوقت، وقد تم تطبيق intravital المجهري نطاق واسع لمختلف مجالات الدراسة في علم المناعة 8. التصوير حيوي داخلي يمكن المناعة لفهم أفضل وتأطير الاستجابات المناعية في كل من المستوى الخلوي والجزيئي في العيش النماذج الحيوانية.
وقد وفرت التطورات الحديثة في مجال المعدلة وراثيا وكذلك تدق في الفئران مراسل أدوات مفيدة لرصد السلوكيات الحيوية العدلات في الحيوانات الحية. الليزوزيم M مدفوعة المروج تعزيز البروتين الفلوري الأخضر تدق فيوقد استخدمت الفئران على نطاق واسع لوصف الحركة من العدلات، وحيدات، والضامة خلال عمليات الالتهابات المختلفة بما في ذلك التسرب، والعدوى البكتيرية، والتهاب عقيم 9-15. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت الفئران المعدلة وراثيا معربا عن حشوية مضان بالرنين نقل الطاقة جهاز الاستشعار البيولوجي في دراسة أنشطة المتعادلة كيناز mitogen خارج الخلية الخاضعة للوائح وبروتين كيناز وداخل الأمعاء الملتهبة 16. نموذج الفئران مع خصوصية عالية للتعبير عن مضان في العدلات هو الضربة القاضية في الماوس صلصة الطماطم، التي تنتج لجنة المساواة العرقية recombinase فضلا عن tdTomato بروتين فلوري، الذي يقترن نفسها في التعبير من اللمفاويات مستضد 6G (Ly6G) 17. وقد أثبتت التصور العدلات Ly6G التي تعاني من نقص عبر هذا النموذج أن هذه الخلايا تمارس وظيفة عادية في مجموعة متنوعة من السياقات التهابات الجسم الحي معقمة أو المعدية في. الفئران المعدلة وراثيا معربا عن عن dsRed الفلورسنت صrotein الجينات تحت سيطرة الماوس interleuikin-1β استخدمت (IL-1β) المروج (pIL1-عن dsRed) لتصور السلوكيات متحركة من الخلايا المنتجة IL-1β – يعتقد انها تضم العدلات، وحيدات التهابات، وتفعيل الضامة – الناشئة في التهاب الجلد 18.
في الجسم الحي العلامات يمكن أن تكون نهجا بديلا لتتبع سلوكيات الخلوية والجزيئية العدلات في الأنسجة الملتهبة. بعد الحقن في الوريد بجرعات منخفضة من fluorescently المسمى مكافحة GR-1 ريتوكسيماب (ماب)، شلال توظيف GR-1 + العدلات وقد تصور في الآفات الجلدية الماوس المصابين المكورات العنقودية الذهبية (19). وفي الجسم الحي إدارة تقارن تحتوي على streptavidin- مترافق 705 نقاط الكم نانومتر والمعقدة البيروكسيديز مكافحة Ly6G ماب تسمية تحديدا العدلات المتداولة 20. وعلاوة على ذلك، الإلتقام هذه تقارن في neutrophالحويصلات ايل تتيح تتبع النقل حويصلة عالية السرعة في العدلات المهاجرة في الخلالي. المجراة وضع العلامات مع الأجسام المضادة مضان مترافق ضد ف selectin بروتين سكري يجند-1 (PSGL-1)، L-selectin (CD62L)، إنتغرين αM (CD11b ) وchemokine (CXC عزر) مستقبلات 2 (CXCR2) في نموذج التهابات الناجمة عن TNFα وإجمال الآليات التنظيمية في اللعب أثناء التهاب في وقت مبكر 21. العدلات الاستقطاب تبرز uropods PSGL-1-التخصيب للتفاعل مع CD62L الحاضر على الصفائح الدموية تفعيلها، مما أدى إلى إعادة توزيع CD11b وCXCR2، المستقبلات التي تدفع الهجرة العدلة والشروع في التهاب.
IL-1β هي واحدة من الجينات التوقيع الذي ارتقى في العدلات معبي 22. في الفئران مراسل pIL1-عن dsRed، وإشارات مضان عن dsRed (أي.، تفعيل المروج IL-1β) ترتبط بشكل إيجابي مع IL-1β التعبير مرنا وإنتاج بروتين IL-1β. <سوب> 18 لمراقبة عملية فتيلة العدلات، وضعت طريقة intravital المجهري تنطوي على تحريض التهاب الجلد مع oxazolone (OX) في نموذج الفأر pIL1-عن dsRed التالية في الجسم الحي وسم العدلات مع مضان مترافق مكافحة Ly6G ماب. عبر هذا النموذج، فمن الممكن لدراسة سلوك وظيفة من العدلات معبي في النماذج الحيوانية من مختلف الأمراض والاضطرابات.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من هذه الدراسة هو تطوير التكنولوجيا لرصد عملية فتيلة العدلات في الحيوانات الحية، التي لم يتم الوفاء بها من خلال التقنيات المتاحة حاليا. ولتحقيق هذا الهدف، نفذت ثلاث منهجيات محددة: 1) تحريض التهاب الجلد في IL-1β عن dsRed الفئران مراسل يحركها المروج كمقياس للفتيلة، 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
